杨建雄生物化学34,35,36章

1、第34章DNA的复制和修复第三十四章1掌握原核生物DAN复制的有关酶和复制过程（重点）；2掌握真核生物DAN复制的特点（重点）；3掌握DNA损伤修复的机制（重点）；4熟悉DNA突变的产生机制。第一节DNA的复制It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material.（一） 一）     DNA的半保留复制 

2、;点击放大DNA半保留复制的实验证据：1958年Meselson和Stahl的实验 （二）DNA复制的起点和方式点击放大型复制 点击放大滚环复制D环复制点击放大点击放大线粒体DNA为D环复制。真核rDNA的扩增，F因子DNA的转移，裂解途经的复制，X174，M13，G4等单链环状DNA噬菌体，第二阶段复制都是滚环复制。（三）DNA聚合反应有关的酶1956年Kornberg发现的DNA聚合酶I（100kg大肠杆菌可以分离0.5g纯化的酶），由一条肽链组成，有53聚合酶活力， 53外切酶活力，和3 5外切酶活力。用蛋白酶水解得到的Klenow片段有3 5外切酶活力和5 3聚合酶

3、活力。DNA聚合酶催化的反应   点击放大点击放大DNA polymerase I has three enzymatic activities in a single polypeptide chain, which can be cleaved into two functional parts by mild protease treatment.点击放大点击放大图示为Klenow片段与DNA的结合，模板链(12nt)为蓝色，引物链(14nt)为红色DNA聚合酶I的Klenow片段与DNA的相互作用DNA聚合酶I的校对作用DNA聚合酶I的5y3外切酶可以从单

4、链切口的5 末端切除核苷酸， 5 y3聚合酶可以用脱氧核苷酸填补缺口。点击放大点击放大点击放大DNA聚合酶的结构点击放大DNA聚合酶的亚基二聚体与DNA结合的空间关系 (顶部观) DNA聚合酶的亚基二聚体与DNA结合的空间关系(立体图)DNA聚合酶有不少于7个亚基，可能参与DNA的修复，1999年发现的DNA聚合酶和可以复制有较多损伤的DNA。DNA连接酶的作用机制。细菌的DNA连接酶以NAD为能源，动物细胞和噬菌体的连接酶以ATP为能源。T4的DNA连接酶可以连接平末端。  点击放大（四）DNA的半不连续复制从寻找失踪的酶到同位素脉冲标记发现冈崎片断 

5、点击放大（五）DNA复制的拓扑性质拓扑异构酶可以消除负超螺旋，对正超螺旋无作用。拓扑异构酶可以在消耗ATP的条件下连续的引入负超螺旋，在无ATP消耗的条件下，可以松弛负超螺旋。真核生物的拓扑异构酶可以消除负超螺旋，也可以消除正超螺旋。真核生物的拓扑异构酶（分为和两种）可以消除负超螺旋和正超螺旋，但不能引入负超螺旋。拓扑异构酶主要和转录有关。拓扑异构酶主要与复制有关。拓扑异构酶引入负超螺旋可以消除复制叉前进时带来的扭曲张力。双螺旋的解开需要解螺旋酶参与。DnaB是一种解螺旋酶，沿模板链的5y 3方向移动，由ATP供能，可能参与复制。解螺旋酶、和沿模板链的5y3方向移动，rep蛋白沿3y 5方向移

6、动，这几种解螺旋酶可能与修复作用有关。SSB可以稳定单链，与单链的结合有协同效应。点击放大（六）DNA复制的过程复制的起始点击放大 大肠杆菌DNA复制的步骤 点击放大 大肠杆菌DNA复制时冈崎片段的合成步骤 点击放大复制的延伸 点击放大点击放大复制的终止 点击放大点击放大（七）真核生物DNA的复制DNA replication in eukaryotic cells use essentially the same principles but being more complex in the details.The best un

7、derstood eukaryotic replication system is that of SV40 and yeast.Formation of the RNA primers and the initial incorporation of deoxynucleotides are believed to be catalyzed by DNA polymerase (which has no proofreading activity).Later chain extension is believed to be catalyzed by DNA polymerase , wh

8、ich has proofreading activity and is clamped onto the DNA templates via the PCNA trimer rings.Specific sequences (150 bp) that can function as replication origins have only been identified in yeast ( is called autonomously replicating sequences, or ARS) and SV40 virus.The rate of DNA synthesis in eu

9、karyotic cells is about one tenth of that of the E.coli cells.Replication in the eukaryotic genomes begin at many replication origins.9 purified proteins are needed to replicate SV40 virus DNA in vitro.T antigen：a multifunctional site-specific DNA binding protein encoded by SV40 DNA, binds to the or

10、igin (as DnaA) and melts the duplex DNA (as DnaB);RPA：encoded by the host mammalian cells and binds to the melted single-stranded DNA (as SSB).Pol /primase：synthesizes the RNA primers and a stretch of DNA sequences, has no proofreading activity.Pol replaces Pol /primase to further extend the RNA-DNA

11、 strand, has proofreading activity. PCNA (proliferating cell nuclear antigen)：a trimeric ring-shaped protein that clamps Pol onto the DNA template.RFC (replication factor C)：a clamp loader for PCNA.Topoisomerases：Relieves the torsional strain induced by the growing replication fork.Ligases：joins the

12、 Okazaki fragments (which is much shorter than those in E.coli cells), as well as the leading strand.几种真核细胞的DNA聚合酶的性质如表中所示，体外或者是体内的实验均证明， DNA聚合酶和可以被抑制剂23-双脱氧胸苷和蚜肠霉素抑制，这些结果可以说明它们是DNA的复制酶。 点击放大DNA聚合酶主要是用来起始链的合成，而DNA聚合酶则是用来延伸新生成的链的。另外两种DNA聚合酶和，则主要是用来参与修复反应的。而DNA聚合酶则是负责线粒体DNA的复制的。原核和真核生物复制体系的比较点击放大

13、 Model of in vitro replication of SV40 DNA by eukaryotic enzymes:1. T antigen (Tag) binds and unwinds replication origin;2. RPA (or RFA) binds to single-stranded DNA;3. Pol -primase synthesizes the primers (RNA + DNA). 点击放大4. RFC loads PCNA to the template.5. PCNA displaces Pol-primase and

14、 functions as a DNA clamp;6. Pol replaces Polprimase and further extends the DNA strands. 点击放大酵母的自主复制区多个ARS(autonomously replicationg sequence)发挥复制起点的功能。酵母染色体的着丝粒附近为ARS1序列，ARS1分为A,B,C三个功能区, A,B起主要作用，C起次要作用。A区为15bp,其中11个保守，称ACS (ARS consensus sequence)。有复制起始子的功能。B区约为80bp,含B1,B2,B3三个功能区。B3是ABF1（A

15、RS-binding factor 1）结合区。ORC(origin recognizing complex)：由6个亚基组成相当于DnaA和的O蛋白，与A/B1结合后结合于游离的DNA。Cdc6:相当于DnaC,及的P蛋白，使Mcm蛋白结合到复合体上。这对于在Origin上起始复制是必须的。 Mcm: DnaB螺旋酶。即 licensing factor.ABF1：（转录因子）结合于B3.酵母DNA复制的起始点击放大  PCNA（增殖细胞核抗原）三聚体的结构与原核生物DNA聚合酶 的亚基二聚体相似。真核生物DNA复制的模式点击放大  以下图示（a）为滞

16、后链末端的引物被切除后会形成缺口，图示（b）为端粒酶可以加长DNA的末端。点击放大点击放大  第二节DNA的损伤修复（一）错配修复大肠杆菌的Dam甲基化酶可以使DNA的GATC序列中A的N6甲基化，新合成的链在短期内未能甲基化，如果有错配碱基对，则需切除新合成链的错配区，MutS二聚体识别并结合到错配碱基部位，mutL二聚体与MutS结合，使DNA形成突环，复合体随ATP水解而移动，直至遇到GATC序列，随后核酸内切酶MutH结合到MutSL上，将未甲基化链GATC位点G的5端切开，若切开处位于错配碱基的3侧，则由核酸外切酶或核酸外切酶X沿3 5方向切除核酸链。若切开处位于

17、错配碱基的5侧，则由核酸外切酶或RecJ沿5 3方向切除核酸链，新的DNA链由DNA聚合酶和连接酶合成并连接。在切除链的过程中，解螺旋酶和SSB帮助链的解开。人类的hMSH2和hMLH1基因编码的蛋白质分别与大肠杆菌的MutS和MutL相对应，错配修复的过程与大肠杆菌相似。点击放大点击放大点击放大（二）直接修复胸腺嘧啶二聚体的形成   点击放大从单细胞生物到鸟类都存在光复活酶，但高等哺乳动物却没有光复活酶，其胸腺嘧啶二聚体需要通过切除才能修复。点击放大（三）切除修复 点击放大点击放大（四）重组修复  点击放大点击放大点击放大点击放大&

18、#160;（五）应急反应(SOS)和易错修复重组蛋白A，在有单链DNA和ATP存在时被激活，并促进LexA的蛋白水解酶活性，因而可被称作辅蛋白酶。LexA的分解使umuDC基因表达DNA聚合酶V，dinB基因表达DNA聚合酶， uvrA,B,O分别表达切除酶的亚基，此外，促进一些其他基因的表达，使有差错的基因可以复制，并在随后被修复。 点击放大图中LexA是多种基因的抑制剂。点击放大点击放大 第三节DNA的突变 （一）突变的类型碱基对的置换：两种嘌呤或两种嘧啶之间的互换称作转换；嘌呤与嘧啶之间的互换称作颠换。引起氨基酸改变称作错义突变；氨基酸密码子变为终止密码子称

19、作无义突变；不引起氨基酸改变称作中性突变。移码突变：一个或多个非三整数倍核苷酸的插入引起阅读框的改变，通常使基因产物完全失活，出现终止码会使翻译提前终止。（二）诱变剂的作用1碱基类似物如5-溴尿嘧啶，酮式与腺嘌呤配对，稀醇式与鸟嘌呤配对，结果使A-T变为G-C，相反则可将G-C变为A-T。 点击放大2-巯基嘌呤是腺嘌呤的类似物，通常与胸腺嘧啶配对，以罕见的亚氨基状态存在时，可以与胞嘧啶配对，使A-T变为G-C，相反则可将G-C变为A-T。点击放大点击放大  2碱基的修饰剂 点击放大3嵌入染料如丫啶类，原黄素，溴化乙锭等可插入碱基对之间，引起核苷酸的插入或

20、缺失。4紫外线和电离辐射紫外线可以使相邻嘧啶之间形成环丁烷结构的二聚体；电离辐射产生的自由基可以使核苷酸链断裂。自由基可以破坏糖环，打断多核苷酸链。 点击放大 自由基可以破坏糖环，打断多核苷酸链。形成错配碱基对的机制  点击放大（三）诱变剂和致癌剂的检测某些调节正常细胞分裂的基因，突变后会使细胞生长失控成为肿瘤，这样的基因突变前称作原癌基因，突变后称作癌基因。抑癌基因可以抑制细胞的恶性生长，突变后会使癌症的发病率增加。Ames实验是检验致癌剂的常用方法，将鼠伤寒沙门氏杆菌组氨酸营养缺陷型菌株接种到含待测物的无组氨酸培养基平皿中，若待测物含有诱变剂，可发生

21、恢复突变，长出的菌落多少可以反映诱变剂的强弱。大肠杆菌的SOS反应可以使溶原态的噬菌体激活，使宿主菌裂解产生噬菌斑，引起细菌SOS反应的化合物对高等动物都是致癌的，用这一方法检测致癌剂，可以大大简化检测方法。第35章DNA的重组基本要求:1熟悉同源重组的机制。2熟悉特异位点重组的机制。3熟悉转座重组的机制。第一节 同源重组一、Holliday模型点击放大二、细菌的基因转移与重组致育因子（F因子）通过结合作用由F+细胞向F-细胞转移，F质粒约1/3的基因与转移有关，traS和traT基因编码表面排斥蛋白，阻止F+细胞之间的转移，F+细胞的性菌毛与F-细胞结合后收缩，使二者靠近，TraD蛋白构成转

22、移的通道，在TraI在TraY的帮助下结合到转移起点oriT上，切开一条链，使其5端进入受体细胞，并合成其互补链，使F-细胞转化为F+细胞，给体细胞中的单链也可以合成互补链。在细菌基因转移的不同时间将配对细胞分开，可以确定基因在染色体上的位置。F质粒DNA可以通过重组整合到受体的染色体中，使受体菌成为高频重组（Hrf）菌株，若F质粒的DNA未能完整地进入受体菌，则受体菌不能转化为F+，F质粒的DNA可以被切割出来，有时可携带宿主菌的染色体DNA，称作F因子，F因子携带的基因可在受体菌表达。三、重组有关的酶依赖RecBCD起始的重组模型：RecBCD有依赖ATP的核酸外切酶、核酸内切酶和解螺旋酶

23、活性，当DNA断裂时，它结合在其游离端，使其解旋并降解，直至酶移动到chi位点（GCTGGTGG），在其3侧4-6核苷酸处将链切断，产生3游离单链，随后单链与RecA结合，开始同源区重组。点击放大RecA蛋白的丝状聚合体与DNA的相互作用点击放大RecA蛋白的带状图解点击放大RecA蛋白的丝状聚合体，每一圈螺旋由6个RecA蛋白单体构成，其中一个单体由红色标出。RecA蛋白引起DNA同源重组的模型点击放大在大肠杆菌中由RuvA，RuvB和RuvC蛋白参与的同源重组。点击放大 （a）RuvA四聚体的图解。四个亚基形成的结构像四个花瓣的花。 （b）RuvA/RuvB的作用： （左）RuvA四聚体结

24、合到Holliday位点； （中）RuvB六聚体结合到杂合双螺旋的两对面，DNA穿过其中心， RuvB六聚体的作用像马达，促进超螺旋分叉点通过复合体移动。 （右）RuvC结合到Holliday位点，由其核酸酶活性切断核酸链，切割位点由剪切体辨认。 （c）RuvA四聚体的电荷分布，蓝色表示正电荷，红色表示负电荷，注意正电荷位于四聚体的表面，有四个负电荷区域位于其中心。（d）假设的RuvA四聚体与Holliday位点结合的结构模型。第二节 特异位点重组 点击放大 点击放大细菌的特异位点重组沙门氏菌两种鞭毛蛋白表达的调控点击放大免疫球蛋白基因的重组IgG的分子结构点击放大点击放大 点击放大 点击放大

25、重组位点有7和9nt的信号序列，中间间隔12或23bp。点击放大免疫球蛋白基因重组的模型点击放大重组酶（RAC1/RAC2）复合体与重组信号序列结合。复合体使编码序列与重组信号序列之间的双连断裂，编码序列的末端形成发夹结构。重组信号序列结合形成环状结构。编码序列连接前经过加工，连接位点不十分确定，增加了免疫球蛋白的多样性。DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）和DNA连接酶参与了加工和连接过程。在不同的核苷酸位点重组可以生成不同的蛋白质。 点击放大第三节 转座重组点击放大一、细菌的转座因子插入因子转座子具有反向末端重复序列以及在靶部位两侧产生的同向重复序列。在该例中靶序列为5bp，转座子末端由9

26、bp反向重复序列组成，数字1-9指序列重复碱基对。点击放大组合型转座子：两个插入序列之间夹着一段序列（可以是某个基因，如抗性基因）。两个插入序列可以同向或反向排列，有时均有转座活性，有时只有一个有转座活性。点击放大复合型转座子：插入序列被转座酶基因取代，图示为Tn3（TnA家族）的结构。两端为38bp的反向重复，其两侧为5bp的靶序列，tnpA编码转座酶，tnpR编码的蛋白质可以作为解离酶（使转座子与受体DNA形成的共整合体重组和解离），也可以作为阻遏蛋白调节tnpA和tnpR两个基因的表达，res为解离的控制位点，TnpR蛋白结合于其上发挥调控作用。转座的方式转座子可用不同的方式转座，转座因

27、子插入基因后可使基因失活，也可引起染色体的断裂、重复、缺失、倒位、易位等变化。点击放大两个IS10组件构成一个复合转座子，它能使位于他们之间的任何DNA易位。当Tn10是一个小的圆形分子的一部分时，IS10重复序列可转座至环状分子的任一侧。插入序列使靶序列的数量增加，在插入序列两侧各有一个。点击放大复制转座作用产生了转座子的一个拷贝，它插入到一个接受位点。给予位点保持不变，以致给予者和接受者都有转座子的一个拷贝。点击放大非复制转座作用在未被修复的情况下，可能造成致死突变。点击放大保守的转座作用不造成核苷酸的丢失，如噬菌体的整合和切除。点击放大转座子引起DNA的重排，正向重复序列的重组引起其间序

28、列的切除或插入。点击放大反向重复序列的重组能引起其间序列反向排列。点击放大转座作用可引起给体和受体的整合或分割，并可引起转座子拷贝数的增加。点击放大二、真核生物的转座因子原核生物的转座酶主要作用于产生它的转座因子，表现出顺式显性。真核生物的转座酶可以作用于任何末端具有该酶所识别的反向重复顺序的DNA，使其转移到相应的靶位点。在玉米的激活-解离系统（activator-dissociation system， Ac-Ds）中，Ac编码转座酶（自主因子），Ds（非自主因子）是Ac不同程度的缺失中间序列形成的，无转座酶活性，但随Ac转座后可抑制邻近基因的表达。在玉米的抑制-促进-增变系统（suppr

29、essor-promotor-mutator，Smp）中，Smp和En（增强子）序列相似，均为自主因子，与其对应的非自主因子dSmp为有缺陷的Smp因子，转座后，若Smp插入靶基因附近的合适部位，可以促进靶位点基因的表达，若Smp插入外显子，可抑制基因的表达。点击放大玉米的控制元件形成转座子的不同家族，每个家族均有自主和非自主成员。点击放大P品系的果蝇含有40-50个P因子（一种转座子）， P因子的mRNA前体含有3个内含子，若P品系雄性与M品系雌性交配，子一代的体细胞mRNA前体加工时保留了第3个内含子，合成阻遏蛋白，不发生转座，性细胞mRNA前体加工时切除了全部3个内含子，活跃的转座使性细

30、胞失去功能。P雄性或M雄性与P雌性交配时，由于雌性的卵细胞质中存在抑制P因子转座酶活性的蛋白质，子代的生殖功能正常。点击放大第四节 真核生物基因表达的转录前调控1染色体丢失：如四膜虫的大核为营养核，由小核发育而来，约10%的DNA在发育过程中被丢失。 2基因扩增：如非洲爪蟾卵母细胞的rDNA可以大量扩增，形成1000个以上的核仁。 3基因重排:重排可以使表达的基因发生切换，也可以产生新的基因。 4组蛋白的乙酰化和去乙酰化：组蛋白的乙酰化和基因表达的状态相关。组蛋白H4的乙酰化不足（underacetylation）是雌性哺乳动物一条X染色体失活的原因之一。去乙酰化和基因活性的阻遏有关。 5染色

31、体DNA的修饰和异染色质化：DNA的甲基化可以使其失去转录活性，高度甲基化的DNA可以形成高度压缩的异染色质，异染色质的基因无转录活性。6染色质结构改变模型-组蛋白置换占先模型（pre-emptive model）：决定的因素是转录因子和组蛋白谁先占据调控位点。DNA复制时，组蛋白8聚体解离，转录因子乘机结合到调控位点上，一直持续到下一个复制周期，抑制了组蛋白和DNA的结合。例1：当5S rRNA基因与组蛋白结合时TFA不能激活此基因。而TFA可与游离的5S rRNA基因结合，再加入组蛋白不能使此基因失活。例2：含腺病毒启动子的质粒能被TFD结合，再被RNA pol 转录，如先加入组蛋白，则不

32、起始转录，如先加入TFD则形成的染色质中，模板仍能转录。动态模型（dynamic model）：组蛋白置换需输入能量。一些转录因子结合DNA时可裂解核小体，或建立一个可产生核小体定位结合位点的边界。如果蝇Hsp70启动子上的核小体在体外实行重建。GAGA（细胞核结合蛋白）转录因子与启动子中4个富含（CT）n位点结合，破坏了核小体，形成一高敏感区，而且导致邻接的核小体重排，这样它们就优先插入到随机位点。核小体打开的过程是需要水解ATP的耗能过程。7细胞周期的调控最关键的是两个蛋白质家族：周期素（cyclin）家族和依赖周期素的蛋白激酶（cyclin-depending protein kinas

33、e，CDK）家族，目前发现的周期素有10种以上，用字母A，B，C等表示，CDK有8种以上，用CDK1，CDK2，CDK3等表示。周期素A，周期素D，CDK2，CDK4的合成受转录因子E2F的调节，他们共同的作用控制着G1期向S期的转化，周期素A和周期素B与CDK2的结合对有丝分裂的启动是必要的。 新合成的促细胞分裂周期素与CDK结合，形成促M期因子（M-phase promoting factor，MPF），活化的CDK使自身的Y15和T161先后被磷酸化，随后细胞周期基因（cell-division-cycle gene）的产物Cdc25将Y15的磷酸基水解，才使MPF活化，使许多靶蛋白磷酸

34、化，导致有丝分裂开始。活化的周期素-CDK复合物还可以激活销毁序列识别蛋白（destruction box recognizing protein，DBRP），DBRP与周期素的销毁序列结合，随后结合泛素，使周期素被蛋白酶体降解。点击放大生长因子受体与配体结合后，其酪氨酸蛋白激酶将一系列蛋白质磷酸化，传递信号到细胞核，促进细胞增殖或分化，如Ras蛋白可以激活促分裂原活化的蛋白激酶（mitoge-activated protein kinase，MAPK），MAPK磷酸化细胞核转录因子，促进细胞增殖。有些生长因子的受体无酪氨酸蛋白激酶活性，借助另外的激酶（just another kinase，

35、JAK）及其底物（signal transducer and activator transcription，STAT）构成的系统传递信号，受体-Ras-Ras和JAK-JAK两个系统及其他系统之间存在相互作用。最早发现的癌基因鸡的肉瘤基因src是酪氨酸蛋白激酶的变体，它无需接受生长信号，使细胞的增殖持续活化。类似的癌基因家族还有很多，如生长因子类sis，酪氨酸激酶类abl，erbB，src等。 许多因素可引起基因突变，使原癌基因转变为癌基因。 抑癌基因可以阻止细胞的过分增值，或使失控的细胞死亡或凋亡。第36章RNA的合成基本要求：1掌握DNA指导下RNA的合成过程和有关的酶。（重点）2熟悉转

36、录的调节控制机制（含教材第39章后半部分）。 （重点）3熟悉RNA的转录后加工。（重点）4掌握RNA指导下RNA和DNA的合成及其意义。（重点第一节 DNA指导下RNA的合成 点击放大 点击放大点击放大 点击放大一、DNA指导的RNA聚合酶原核生物的RNA聚合酶由2构成核心酶，为起始因子，因子引导RNA聚合酶稳定地结合到DNA的启动子上，不同的菌种因子的大小差别很大,不同的因子可以识别不同的启动子，亚基借助疏水作用与DNA结合,亚基是碱性蛋白，借助静电作用与DNA结合，构成RNA聚合酶的催化中心，亚基与启动子上游元件和活化因子结合，促进酶的装配，因子参与某些基因转录的终止。真核生物的RNA聚合

37、酶对-鹅膏蕈碱不敏感，转录45S rRNA前体，经加工产生5.8S rRNA，18S rRNA 和28S rRNA； RNA聚合酶对-鹅膏蕈碱敏感，转录编码蛋白质的基因和大多数snRNA；RNA聚合酶 对-鹅膏蕈碱中等敏感，转录小RNA，包括tRNA，5S rRNA， snRNA和scRNA 。转录的步骤点击放大研究转录起点的方法：足迹法点击放大二、启动子和转录因子原核生物的启动子点击放大真核生物RNA聚合酶启动子的共有序列 RNA聚合酶基本启动子的共有序列TATA位于-25至 -30，转录起始部位有一保守序列PyPyA*NT（A）PyPy, 其中的Py表示嘧啶，*表示+1位点。上游调控元件包

38、括CAAT框，GC框和八聚体框等，位置不很确定，不同的细胞可以有不同的上游调控元件，不同的上游调控元件与不同的转录因子相互作用（表36-4）。 点击放大真核生物RNA聚合酶启动子与转录因子的相互作用点击放大TFD是包含TATA结合蛋白（TATA-binding protein,TBP）和多种TBP联结因子（TBP-associated factor,TAF）的寡聚蛋白，可以与RNA聚合酶的C端相互作用。TFB有两个结构域，一个结合TBP。另一个可以引进TFF/pol复合物。TFF有ATP酶，解螺旋酶，激酶等多种活性，可以使RNA聚合酶大亚基的C端磷酸化，引起构像变化，促进转录。还可以参与DNA

39、损伤的修复。黄色为TATA box的糖磷酸骨架，碱基对为红色，相邻的DNA片段为蓝色，马鞍形的TBP（绿色）结合在DNA的小沟，使小沟扩大，并使DNA轴弯曲约100o，使TATA序列解旋。TFD杂聚体的其它组分位于TBP上方，像骑在马鞍上的牛仔。所有真核生物的基因均依赖于TBP。E和H促进除F以外的其他转录因子脱落，使转录由起始阶段进入延伸阶段。点击放大前起始复合物的结构。显示pol，TATA box，TBP，TFB（B），TFE（E）的相对位置。转录起始于pol和TFE环绕的区域。电脑构建的TFA-TBP-TFB复合物的结构。注意蛋白质引起的DNA上游和下游的错位。 点击放大 点击放大RNA

40、聚合酶的核心启动子位于-45至+20，上游控制元件位于-180至-107，两部分均有富含GC的区域。转录因子UBF1可结合于两部分富含GC的区域，随后结合SL1四聚体蛋白（作用类似与原核生物的因子）。 RNA聚合酶的启动子有3种类型，基因内启动子有两种，一种由boxA-中间元件-boxC组成，转录起始时，TFA（一种锌指蛋白）结合到boxA上，然后 TFC（至少5个亚基组成的复合物）结合，后者促进TFB（含有TBP和另外两种蛋白质，能使RNA聚合酶正确定位）结合，并引导RNA聚合酶结合到起始位点上。 另一种由boxA-间隔区-boxB组成，转录起始时， TFC识别boxB，其结合区包括boxA

41、 和boxB，然后依次引导 TFB和RNA聚合酶的结合。第3类启动子位于转录起点的上游， RNA聚合酶可以结合到其中的TATAbox并起始转录，但其上游的邻近序列元件（proximal sequence element, PSE）和八聚体基序（octamer motif, OCT）会增加转录的效率。转录的解螺旋方式如果RNA缠绕在DNA双螺旋上，不会产生超螺旋，但通过这种模式解开双螺旋进行转录是不可能的。拓扑异构酶可以解除超螺旋，使转录泡移动。点击放大三、终止子和终止因子 大肠杆菌有两类终止子，不依赖于因子的为简单终止子，能形成发夹区，其中常有一段富含G-C区，终点前有一段寡聚U，可能提供RN

42、A聚合酶脱离模板的信号，同时，寡聚U容易从模板脱落。 依赖于因子的终止子发夹区不含富G-C区，其后也无寡聚U，在细菌中少见，但在噬菌体中广泛存在。因子为六聚体蛋白质，可结合在新合成的RNA链上，借助水解NTP的能量移动，RNA聚合酶遇到终止子时停止移动，因子追上来与其结合，促进RNA聚合酶脱落，并使RNA从模板脱离。 抗终止子可使终止子通读，促进其后的基因转录，噬菌体的前早期基因的产物N蛋白是一种抗终止子，可以使终止子通读，使晚早期基因表达，晚早期基因的产物Q蛋白也是一种抗终止子，能使晚期基因得以表达。 真核生物转录的终止了解不多。点击放大点击放大识别终止子还需要NusA，NusB，NusE，

43、NusG等因子参与，有关问题有待深入研究。第二节 转录的调节控制一、原核生物转录的调节控制1操纵子的结构和调控原核生物的不少基因在加入诱导物后mRNA迅速合成，随之酶滞后合成。当去除诱导物时mRNA的合成很快停止，但酶的合成延迟停止。构建部分二倍体（lacI-/FlacI+）。 lacs为阻遏蛋白不可诱导性突变，其阻遏蛋白失去诱导物结合位点； lacI-突变的阻遏蛋白不能形成寡聚物； lacI-d突变的阻遏蛋白不能和DNA结合，且呈负互补（反式显性）； Oc操纵基因的突变使结构基因组成型表达。 由此提出操纵子学说。点击放大（1）大肠杆菌乳糖操纵子的结构点击放大大肠杆菌乳糖操纵子的作用方式点击放

44、大（4）大肠杆菌的色氨酸操纵子点击放大特点: （1） trpR（89）和trpABCDE（25）不连锁； （2） 操纵基因在启动子内； （3） 有衰减子（attenuator）； （4） 启动子和结构基因不直接相连，二者被前导顺序（Leader）所隔开。调节： （1） Trp为辅阻遏物（corepressor）； （2）阻遏物和RNA pol 在P,O重叠区产生竞争性抑制； （3）阻遏物的阻遏能力低，是LacR的1/1000；（4）trpO调节合成代谢，存在衰减作用。点击放大色氨酸操纵子的阻遏物辨认三种操纵基因。点击放大色氨酸操纵子转录本前导区二级结构的变换点击放大缺乏多种氨基酸则前导肽不能合

45、成，转录被终止。色氨酸含量很低，但不缺乏其他氨基酸时，前导肽的合成在色氨酸密码子处停顿，不形成终止子，转录可以完成。有高浓度色氨酸存在时，前导肽顺利合成，核糖体占据1和2，使3和4形成发夹结构，转录被终止。色氨酸操纵子衰减作用的机制点击放大几种氨基酸合成操纵子的衰减作用前导肽的氨基酸序列点击放大2生长速度的调控 营养丰富，温度适宜时，细菌的生长速度可以很快，在两个细胞尚未分裂的情况下，新一代的DNA已经开始合成，大肠杆菌的倍增时间为25分钟时，平均每个细胞的DNA分子为4.5个，核糖体的数目也很多。当营养严重缺乏时，细菌进入严紧控制状态，氨基酸的缺乏使细菌合成ppGpp或pppGpp，这一信号

46、使细菌的大部分蛋白质合成停止，只合成对生存必不可少的少量蛋白质。3基因表达的时序调控 噬菌体基因表达的时序调控研究较深入，其50个基因组成4个操纵子，即阻遏蛋白操纵子，左右两个早期操纵子和晚期操纵子，左向转录的为L链，右向转录的为R链，当噬菌体侵入宿主细胞后，前早期和后早期的基因首先表达，随后，若晚期基因表达，噬菌体进入裂解循环，若合成阻遏蛋白，则进入溶原状态。右早期操纵子的调节基因cro可抑制溶原型阻遏蛋白cI的合成，使噬菌体进入裂解循环，左早期操纵子的调节基因N的表达产物为抗终止子，使前早期基因的转录越过终止信号进入后早期基因，后早期基因包括左右早期操纵子的3个调节基因，c/c与建立溶原状

47、态的阻遏蛋白的合成有关，Q调节基因的产物亦为抗终止子，使晚期基因表达，噬菌体进入裂解循环。 基因表达的时序调控是发育生物学的基础。第三节 真核生物转录的调节控制1顺式作用元件： 指可影响自身基因表达活性的DNA序列，包括：核心启动子，如 TATA 框；上游启动子，如 CAAT框,GC框；远上游顺序，如增强子，衰减子、 静息子，酵母的UAS（upstream activator sequences）等；特殊细胞中的启动子成分，如淋巴细胞中的Oct（octamer）和B。2反式作用因子： 转录调节因子由某一基因表达后，通过与特异的顺式作用元件相互作用（DNA-蛋白质相互作用），或通过与其它调节因子

48、的相互作用（蛋白质-蛋白质相互作用），反式激活另一基因的转录，可以分为3类； 通用反式作用因子，主要识别启动子的核心启动成分，如TBP； 特殊细胞的反式作用因子，如淋巴细胞中的Oct-2； 同反应性元件（response elenents）结合的反式作用因子，如HSE（热休克反应元件，heat shock response element），GRE（糖皮质激素反应元件glucocorticoid response element）；MRE（金属反应元件，metal response element）；TRE（肿瘤诱导剂反应元件，tumorgenic agent response element

49、）相应的反式作用因子。3几种真核生物promoter的结构点击放大 真核生物的promoter与增强子的距离和方向差别很大，转录因子与增强子结合促进其与promoter靠近，并促进基因的表达。点击放大 金属硫蛋白的promoter由多个元件构成，特异应答元件如MREs（金属应答元件）和GRE（糖皮质激素应答元件）。BLEs元件（基础水平元件）与基础表达（组成性表达）有关，TRE是一个肿瘤应答元件，可以被促肿瘤佛波脂如TPA（tetradecanoyl phorbol acetate,四癸基佛波乙酸脂）活化。AP为反式作用因子。点击放大 增强子通过蛋白质介导与promoter相互作用，形成的DN

50、A环使增强子结合的特异转录因子与同promoter结合的转录因子及RNA聚合酶相互作用。转录因子与RNA聚合酶的蛋白质：蛋白质相互作用活化基因的转录。点击放大4DNA结合蛋白基序的结构（1）螺旋-转角-螺旋基序二聚体与DNA的二重对称位点结合，辨认螺旋（红色）与DNA的大沟结合，另一个螺旋（紫色）帮助辨认螺旋锁定在特定的位置。点击放大几种蛋白质中的螺旋-转角-螺旋基序点击放大蛋白质与DNA的双位点相互作用点击放大（2）Zn-指C2H2基序与DNA的相互作用。3个Zn-指基序与DNA半个螺旋的大沟结合，Zn-指的螺旋指向大沟，与大沟的碱基对相互作用。Zn-指基序点击放大二级结构点击放大Cx家族Z

51、n-指蛋白质的特征点击放大（3）亮氨酸拉链C/EBP*的C-末端螺旋结构，Leu处于螺旋的一侧。即CCAAT and Enhancer Binding Protein，从小鼠肝脏提取的一种耐热的DNA结合蛋白。点击放大雌激素受体的DNA结合结构域与DNA辨认元件的相互作用。点击放大11种特异性结合蛋白碱性区和亮氨酸拉链区序列的比较点击放大亮氨酸拉链二聚体bZIP蛋白质的结构点击放大bZIP蛋白质杂二聚体转录因子c-Fos:c-Jun结合于DNA的AP-1共有靶序列TGACTCA点击放大三、转录的抑制剂1嘌呤和嘧啶的类似物：如6-巯基嘌呤在体内可以转变为巯基嘌呤核苷酸，阻断嘌呤核苷酸的生物合成，

52、从而抑制转录。5-氟尿嘧啶是尿嘧啶的类似物，可以掺入RNA，5-氯，5-溴，5-碘尿嘧啶是胸腺嘧啶的类似物，可以掺入DNA，并可以引起碱基配对的错误。上述化合物可作为抗癌药使用。 2DNA模般功能的抑制剂：烷化剂可以使DNA烷基化，通常有致癌作用；放线菌素D可以插入碱基平面之间，抑制转录作用，色霉素A，橄榄霉素，光神酶素有类似的作用；嵌入染料如丫啶和菲锭可以使DNA发生移码突变，抑制复制和转录。 3RNA聚合酶的抑制剂：利福霉素（或利福平），利链霉素可以和原核生物RNA聚合酶的亚基结合，抑制转录，-鹅膏蕈碱可以抑制真核生物的转录。利福霉素和利福平:转录起始的抑制剂点击放大蛹虫草菌素：转录起始的

53、抑制剂-鹅膏蕈碱是真核生物转录的抑制剂点击放大第四节 RNA的转录后加工一、原核生物中RNA的加工原核生物rRNA的加工 点击放大 点击放大点击放大tRNA的加工点击放大原核生物的mRNA一般不需要加工即可直接翻译，但有些多顺反子mRNA在翻译前被切割成单顺反子。二、真核生物中RNA的一般加工点击放大真核生物rRNA前体的甲基化，假尿嘧啶化和切割是由核仁小RNA（small nucleolar RNA, snoRNA）指导的，酵母和人类细胞中已发现上百种snoRNA。 多数真核生物rRNA的基因不含内含子，少数含有内含子的有的不转录，有的转录后会自动切除。 点击放大 点击放大真核生物mRNA的

54、加工真核pre-mRNA有3种不同的帽子结构，帽子结构对翻译的起始和mRNA的稳定有重要作用。点击放大靠近末端的AAUAAA为链的切断和多聚腺苷酸化提供信号，链的切断由RNase 催化，多聚腺苷酸化由多聚腺苷酸聚合酶催化，此外还需要多种蛋白质参与。冬虫夏草素是多聚腺苷酸化的特异抑制剂。甲基化和切割hnRNA的一些位点可以被甲基化，随后进行切割，切割的过程十分复杂。点击放大转录本3末端下游10至30个核苷酸处有加尾信号AAUAAA，核酸内切酶切断初级转录本，Poly（A）聚合酶在3羟基添加Poly（A）。三、RNA的拼接、编辑和再编码Group I introns are found in some nuclear, mitochondrial and chloroplast genes encoding rRNAs, mRNAs, and tRNAs.Group II introns are often found in genes encoding mRNAs in mitochondri