《研究氨基酸生产》ppt课件

1、 前前 言言 对微生物的代谢途径及代对微生物的代谢途径及代谢网络进展有目的的改造从谢网络进展有目的的改造从而提高氨基酸的产量依然是而提高氨基酸的产量依然是现代生物工程学的一个主攻现代生物工程学的一个主攻目的。为了攻克这个目的，目的。为了攻克这个目的，就有必要对尚待进一步完善就有必要对尚待进一步完善的细胞生理学、生物化学、的细胞生理学、生物化学、分子生物学及生物过程工程分子生物学及生物过程工程等学科的根本情况做一番描等学科的根本情况做一番描画，主要有如下几个话题画，主要有如下几个话题: 与生物工程相关的氨基酸产生与生物工程相关的氨基酸产生菌的相关途径的研讨进展情况，菌的相关途径的研讨进展情况，其

2、中必需包括这些途径的代谢调其中必需包括这些途径的代谢调理以及细胞的整个调理网络的研理以及细胞的整个调理网络的研讨进展情况。讨进展情况。 对一切的相关途径进展详细的代谢流对一切的相关途径进展详细的代谢流量分析。这涉及到基质进入细胞的碳架量分析。这涉及到基质进入细胞的碳架物流量，流经向心途径、中心代谢途径物流量，流经向心途径、中心代谢途径和离心途径的碳架物流量，以及代谢中和离心途径的碳架物流量，以及代谢中间产物流出细胞的碳架物流量间产物流出细胞的碳架物流量 the central and peripheral carbon fluxes。 复原力的流量复原力的流量 redox flux 及能量流及

3、能量流量量energy flux。以协调和调理的方式对碳架流、氧以协调和调理的方式对碳架流、氧化复原反响的电子流、能量流进展导化复原反响的电子流、能量流进展导向，以提高基质的吸收才干、限制前向，以提高基质的吸收才干、限制前体物向支路途径的流量、减少中间产体物向支路途径的流量、减少中间产物的积累及副产物的构成，还要绕过物的积累及副产物的构成，还要绕过氧化复原平衡及能量平衡中能够出现氧化复原平衡及能量平衡中能够出现的难题。的难题。 传统的设计育种传统的设计育种 随机诱变加定随机诱变加定向挑选，以及向挑选，以及DNA重组技术在设计重组技术在设计育种中的运用曾经大大提高了育种中的运用曾经大大提高了 微

4、生物微生物对氨基酸的消费才干，对氨基酸的消费才干， 但人们对于氨但人们对于氨基酸产生菌的生理学与生物化学等基酸产生菌的生理学与生物化学等 主主要领域的根底知识还相当匮乏。要领域的根底知识还相当匮乏。 目前可从以下几方面了解氨基酸目前可从以下几方面了解氨基酸的代谢根底：的代谢根底： 具有生物工程学重要性的微生物的具有生物工程学重要性的微生物的根本代谢途径及其对应的酶的性质；根本代谢途径及其对应的酶的性质；酶及其调理方式，途径及其调理方酶及其调理方式，途径及其调理方式；式；中心代谢途径及离心途径代谢流量中心代谢途径及离心途径代谢流量的定量分析；的定量分析；对跨膜传送基质吸收和产物分泌对跨膜传送基质

5、吸收和产物分泌的详尽的了解。的详尽的了解。 目的产物的合成途径是了解氨基酸目的产物的合成途径是了解氨基酸消费的前提和中心内容消费的前提和中心内容 。相关的代谢途。相关的代谢途径不仅包括那些直接导致某特定氨基酸径不仅包括那些直接导致某特定氨基酸的合成的公用途径，也包括提供前体碳的合成的公用途径，也包括提供前体碳架物的途径、从公用途径分流最终导致架物的途径、从公用途径分流最终导致副产物生成的分支途径、相应氨基酸本副产物生成的分支途径、相应氨基酸本身被降解的途径、以及那些提供复原力身被降解的途径、以及那些提供复原力和代谢能量的途径。和代谢能量的途径。 除了以上这些反映代谢途径根本除了以上这些反映代谢

6、途径根本信息的资料外，代谢流量的相对固定信息的资料外，代谢流量的相对固定的分布以及代谢流量的动力学呼应同的分布以及代谢流量的动力学呼应同样是至关重要的。这既涉及到中心代样是至关重要的。这既涉及到中心代谢途径提供碳架物质、复原力及代谢途径提供碳架物质、复原力及代谢能的代谢流的定量分析，又涉及谢能的代谢流的定量分析，又涉及到特定氨基酸公用的合成途径的代谢到特定氨基酸公用的合成途径的代谢流的定量分析。流的定量分析。 此外，基质吸收和目的产物输出等此外，基质吸收和目的产物输出等有方向性的跨膜反响对于氨基酸的消费有方向性的跨膜反响对于氨基酸的消费也是极其重要的。除大肠杆菌外，普通也是极其重要的。除大肠杆

7、菌外，普通工业微生物基质吸收方面的知识是相当工业微生物基质吸收方面的知识是相当欠缺的。氨基酸跨膜输出的研讨领域近欠缺的。氨基酸跨膜输出的研讨领域近年才遭到关注。方向性的跨膜反响的机年才遭到关注。方向性的跨膜反响的机理、微生物能学及氨基酸分泌的调理等理、微生物能学及氨基酸分泌的调理等方面的知识对于了解氨基酸消费过程也方面的知识对于了解氨基酸消费过程也是相当重要的。是相当重要的。 我们将一同回想发酵法消费氨基酸的我们将一同回想发酵法消费氨基酸的代谢根底的建立过程，一同讨论代谢流量代谢根底的建立过程，一同讨论代谢流量分析对于了解细胞生理的意义和氨基酸生分析对于了解细胞生理的意义和氨基酸生物合成的代谢

8、工程，还将一同讨论跨膜保物合成的代谢工程，还将一同讨论跨膜保送方面为数不多的研讨任务，以及这方面送方面为数不多的研讨任务，以及这方面研讨对于微生物过量合成氨基酸的意义。研讨对于微生物过量合成氨基酸的意义。在此根底上，讨论以氨基酸为目的产物的在此根底上，讨论以氨基酸为目的产物的微生物代谢设计的新进展和新方法。微生物代谢设计的新进展和新方法。1. 氨基酸消费的代谢根底氨基酸消费的代谢根底2. 氨基酸生物合成的代谢流量氨基酸生物合成的代谢流量 分析分析3. 基质的跨膜吸收与氨基酸的基质的跨膜吸收与氨基酸的 跨膜输出跨膜输出4. 氨基酸消费的代谢设计氨基酸消费的代谢设计 氨基酸消费的代谢根底氨基酸消费

9、的代谢根底1.1 氨基酸的生物合成氨基酸的生物合成1.2 代谢产物消费的生理代谢产物消费的生理学学 1. 1 氨基酸消费的代谢根底氨基酸消费的代谢根底 氨基酸的生物合成涉及以下氨基酸的生物合成涉及以下5个方个方面：面： 1基质吸收；基质吸收；2进入中心代谢途径前的预备途径；进入中心代谢途径前的预备途径；3经中心代谢途径产生碳架化合物经中心代谢途径产生碳架化合物氨基酸的前体化合物、复原力氨基酸的前体化合物、复原力如如NADPH、NADH 和代谢能和代谢能 ATP 和磷酸烯醇式丙酮酸等；和磷酸烯醇式丙酮酸等； 4经过同化经过同化 合成合成 途径将碳途径将碳架化合物转化成目的氨基酸，此过架化合物转化

10、成目的氨基酸，此过程涉及到复原力与代谢能的供需平程涉及到复原力与代谢能的供需平衡，同时也涉及主要载流途径与分衡，同时也涉及主要载流途径与分支途径之间的关系；支途径之间的关系； 5目的氨基酸的跨膜输出等；目的氨基酸的跨膜输出等；6目的产物进一步代谢的途径。目的产物进一步代谢的途径。 谷氨酸棒杆菌中赖氨酸的合成谷氨酸棒杆菌中赖氨酸的合成是研讨得最为广泛的。图是研讨得最为广泛的。图 2 列出了列出了谷氨酸棒杆菌中天冬族氨基酸生物谷氨酸棒杆菌中天冬族氨基酸生物合成相关的途径及重要步骤的代谢合成相关的途径及重要步骤的代谢调理情况。调理情况。基质基质异化途径同化途径氨基酸副产物降解途径氨基酸全局调节系统跨

11、膜吸收碳架、复原力、代谢能跨膜输出重吸收反响调理图图1. 微生物细胞合成氨基酸的微生物细胞合成氨基酸的相关途径及代谢调理表示图相关途径及代谢调理表示图 其中，各相关酶及其中，各相关酶及途径程度上的代谢调理，途径程度上的代谢调理，以及整个细胞程度上的以及整个细胞程度上的全局调理对于代谢流的全局调理对于代谢流的导向和改造是至关重要导向和改造是至关重要的。对微生物整个代谢的。对微生物整个代谢网络进展有目的的改造网络进展有目的的改造和设计涉及到大范围的和设计涉及到大范围的遗传改造。遗传改造。 该同化合成途径经过草酰乙酸该同化合成途径经过草酰乙酸 OAA与中心代谢途径相接，天冬氨与中心代谢途径相接，天冬

12、氨酸是该族氨基酸的共同前体物。酸是该族氨基酸的共同前体物。 来自回来自回补途径及补途径及TCA 环的草酰乙酸，环的草酰乙酸， 进入合进入合成途径并在天冬氨酸成途径并在天冬氨酸 - 半醛半醛 ASA处分为两条支路，一条通往赖氨酸，另处分为两条支路，一条通往赖氨酸，另一条通往苏氨酸、蛋氨酸一条通往苏氨酸、蛋氨酸 甲硫氨酸甲硫氨酸 及异亮氨酸。该途径上主要调控点是天及异亮氨酸。该途径上主要调控点是天冬氨酸激酶冬氨酸激酶 AK ，其他重要的酶包，其他重要的酶包括高丝氨酸脱氢酶括高丝氨酸脱氢酶 HDH 和苏氨酸和苏氨酸脱氢酶脱氢酶TDH。 再往后的流量控制点是是通往赖再往后的流量控制点是是通往赖氨酸氨酸

13、 DDP合酶见图中合酶见图中DHDPS 以以及赖氨酸的需能输出。要获得令人称及赖氨酸的需能输出。要获得令人称心的结果，必需全面思索这些方面，心的结果，必需全面思索这些方面，仅仅对于个别反响即使是最重要的仅仅对于个别反响即使是最重要的调控点进展改造并不是理想的方法，调控点进展改造并不是理想的方法，Broer 等曾将脱敏的等曾将脱敏的 AK 的基因导入的基因导入野生菌中进展表达，但并未获得很令野生菌中进展表达，但并未获得很令人称心的赖氨酸产量。人称心的赖氨酸产量。 该途径上另一值得关注的该途径上另一值得关注的特征是从六氢吡啶二羧酸出发特征是从六氢吡啶二羧酸出发合成二氨基庚二酸的旁路途径合成二氨基庚

14、二酸的旁路途径的出现，借助于的出现，借助于 NMR 手段曾手段曾经得知，旁路的出现依赖于某经得知，旁路的出现依赖于某些代谢条件，特别是可利用的些代谢条件，特别是可利用的NH4+的存在。的存在。 另一个重要的方面是参与特定氨另一个重要的方面是参与特定氨基酸合成途径及与之相关的其他代谢途基酸合成途径及与之相关的其他代谢途径的酶的调理特性，包括酶活力的调理径的酶的调理特性，包括酶活力的调理和酶的表达的调理。特别是必需详细研和酶的表达的调理。特别是必需详细研讨中间产物或终端产物对途径起点或分讨中间产物或终端产物对途径起点或分支处的关键酶的调理。支处的关键酶的调理。 图图2.2. 天冬族氨基酸的生物合成

15、及代谢调理.(其中 表示反响抑制； 表示反响阻遏)IR缩写符号：缩写符号：ASA为天门冬氨酸为天门冬氨酸-半醛，半醛，H s e 为 高 丝 氨 酸 ，为 高 丝 氨 酸 ，SucAKPA为琥珀酰二氨为琥珀酰二氨基庚二酸；基庚二酸；AK为天冬氨为天冬氨酸激酶，酸激酶，DHDPS为二氢为二氢吡啶二羧酸合酶，吡啶二羧酸合酶，HDH为高丝氨酸脱氢酶，为高丝氨酸脱氢酶，HK为高丝氨酸激酶，为高丝氨酸激酶，TDH为为苏氨酸脱氢酶，苏氨酸脱氢酶，AHAS为为乙酰羟酸合酶；乙酰羟酸合酶； PEPS为为PEP合成酶，合成酶，PK为丙酮为丙酮酸激酶，酸激酶，PC为丙酮酸羧为丙酮酸羧化酶，化酶，OAADC为草酰乙

16、为草酰乙酸脱羧酶，酸脱羧酶，PEPC为为PEP羧化酶，羧化酶，PEPCK为为PEP羧激酶。羧激酶。PYRAcCoAOAATCACTAHDHhomDHDPSdapAAspAsp-PAKlysCASAHseIMetDDPSucAKPADAPLysHKthrBIleThrTDHilvAAHASilvBNIThrLysIThrMetRMetRIle，Leu,ValRIleIIleIEMPPEPPEPCPEPCKPCOAADCPKPEPSGlcG6PPTS奇特三角区 要想根据细胞粗提取液的测定要想根据细胞粗提取液的测定结果对这些酶的调控性质做出适当结果对这些酶的调控性质做出适当的解释是靠不住的。这一方面

17、是由的解释是靠不住的。这一方面是由于它们在这些条件下能够不稳定；于它们在这些条件下能够不稳定；另一方面，对于需求什么样的辅因另一方面，对于需求什么样的辅因子才干坚持它们的活性或和它子才干坚持它们的活性或和它们在缓冲液中的稳定性，也知之甚们在缓冲液中的稳定性，也知之甚少；而且特别是由于在抽提的过程少；而且特别是由于在抽提的过程中，那些参与胞内酶活性调理的必中，那些参与胞内酶活性调理的必需因子会丧失。需因子会丧失。 谷氨酸棒杆菌中存在谷氨酸棒杆菌中存在 - 酮戊二酮戊二酸脱氢酶便是一例。人们最初以为酸脱氢酶便是一例。人们最初以为这个酶在谷氨酸棒杆菌中并不存在。这个酶在谷氨酸棒杆菌中并不存在。正由于

18、如此，才出现了这样的假设，正由于如此，才出现了这样的假设，即：即：TCA 环在该处的中断引起环在该处的中断引起 - 酮戊二酸的酮戊二酸的 “ 溢出溢出 ， 最终导致谷最终导致谷氨酸的分泌。后来才弄清这个酶在氨酸的分泌。后来才弄清这个酶在谷氨酸棒杆菌中实践上是存在的，谷氨酸棒杆菌中实践上是存在的，但是它似乎很不稳定。但是它似乎很不稳定。 另外，在关于代谢流的研讨中另外，在关于代谢流的研讨中有迹象阐明，在谷氨酸棒杆菌中有迹象阐明，在谷氨酸棒杆菌中-酮戊二酸脱氢酶的活性已被调低了酮戊二酸脱氢酶的活性已被调低了dawn-regulated， 但这在细胞但这在细胞抽提物中至今不能得到证明。进展抽提物中至

19、今不能得到证明。进展详细的代谢流量包括相关中间产详细的代谢流量包括相关中间产物的流量分析，或许是处理这一物的流量分析，或许是处理这一问题的独一方法。问题的独一方法。 正确描画代谢网络的主要节点的正确描画代谢网络的主要节点的调控方式是非常必要的，但经常是非调控方式是非常必要的，但经常是非常困难的。谷氨酸棒杆菌中丙酮酸和常困难的。谷氨酸棒杆菌中丙酮酸和磷酸烯醇式丙酮酸节点的复合方式就磷酸烯醇式丙酮酸节点的复合方式就是最好的例子。谷氨酸棒杆菌中是最好的例子。谷氨酸棒杆菌中PEP、PYR和和OAA所构成的所构成的 “ 奇特三角区奇特三角区 magic triangle是研讨的热点是研讨的热点 。Glc

20、PEPPYRAcCoAOAAG6PGlc注：注：PK, PC,PEPC, PEPCK,OAADC,PEPS, PTS奇特三角区奇特三角区 PEP经过经过PYR和和AcCoA向向TCA环提环提供供C2单位，同时，单位，同时，PEP、PYR 以及以及 AcCoA 还经过回补反响还经过回补反响 经过乙醛酸环经过乙醛酸环为为TCA环提供重要中间产物，这些回补环提供重要中间产物，这些回补反响对于以反响对于以TCA环代谢中间产物环代谢中间产物 为前体为前体的氨基酸的消费来说是非常必要的。的氨基酸的消费来说是非常必要的。 该区包含能够有多达七个酶的参与，该区包含能够有多达七个酶的参与，其中磷酸烯醇式丙酮酸羧

21、化酶其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEPC、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 PEPCK 、丙酮酸激酶丙酮酸激酶 PK 、 草酰乙酸脱羧草酰乙酸脱羧酶酶 OAADC 和磷酸烯醇式丙酮酸磷和磷酸烯醇式丙酮酸磷酸转移酶系统酸转移酶系统PTS都已得到鉴定，都已得到鉴定，磷酸烯醇式丙酮酸合成酶磷酸烯醇式丙酮酸合成酶 PEPS 已已被假定存在。丙酮酸羧化酶被假定存在。丙酮酸羧化酶 PC 的的存在已得到代谢流量分析的实验数据的存在已得到代谢流量分析的实验数据的支持。支持。 合成代谢途径通常受反响抑制和合成代谢途径通常受反响抑制和反响阻遏的严风格控，比如反响阻遏的严风格控，比如 图图2 中的中的AK

22、、HDH、TDH、AHAS等。等。 不过，不过，相对于大肠杆菌而言，谷氨酸棒杆菌相对于大肠杆菌而言，谷氨酸棒杆菌中的调理尤其是天冬族氨基酸合成途中的调理尤其是天冬族氨基酸合成途径的调理还是比较简单的。径的调理还是比较简单的。 研讨阐明，仅仅研讨与合成途径直研讨阐明，仅仅研讨与合成途径直接相关的酶的调理以及复原力和能量的接相关的酶的调理以及复原力和能量的供应，以及对供应，以及对“瓶颈处关键酶的解调瓶颈处关键酶的解调理或过量表达仍是不够的。中心代谢途理或过量表达仍是不够的。中心代谢途径和合成代谢途径，特别是合成代谢途径和合成代谢途径，特别是合成代谢途径，同全局调控机制亲密相关，如紧缩径，同全局调控

23、机制亲密相关，如紧缩控制、营养阻遏、供氧控制、氮源调理、控制、营养阻遏、供氧控制、氮源调理、浸透压调理及生长阶段调理等。这些问浸透压调理及生长阶段调理等。这些问题对于氨基酸的合成非常重要，但对它题对于氨基酸的合成非常重要，但对它们了解得并不多。们了解得并不多。 氨基酸的消费中经常用到特定的氨氨基酸的消费中经常用到特定的氨基酸营养缺陷型菌株。一方面，在分成基酸营养缺陷型菌株。一方面，在分成两支的氨基酸合成途径中，一个分支途两支的氨基酸合成途径中，一个分支途径的终端产物氨基酸的营养缺陷，通常径的终端产物氨基酸的营养缺陷，通常对另一分支的终端产物氨基酸的合成起对另一分支的终端产物氨基酸的合成起促进作

24、用。促进作用。(其中 表示反响抑制； 表示反响阻遏)图图3.3.天冬族氨基酸过量合成的机理IRPYRAcCoAOAATCACTAHDHhomDHDPSdapAAspAsp-PAKlysCASAHseIMetDDPSucAKPADAPLysHKthrBIleThrTDHilvAAHASilvBNIThrLysIThrMetRMetRIle,Leu,ValRIleIIleIEMPPEPPPCPCKPCODCPKPPSGlcG6PPTS比如图比如图 3 中，谷中，谷氨酸棒杆菌中高氨酸棒杆菌中高丝氨酸缺陷或苏丝氨酸缺陷或苏氨酸缺陷的赖氨氨酸缺陷的赖氨酸消费菌株，大酸消费菌株，大肠杆菌中甲硫氨肠杆菌中甲

25、硫氨酸缺陷、二氨基酸缺陷、二氨基庚二酸缺陷或异庚二酸缺陷或异亮氨酸缺陷的苏亮氨酸缺陷的苏氨酸消费菌株。氨酸消费菌株。 另一方面，某些化合物对菌体生长的另一方面，某些化合物对菌体生长的限制，不论是氨基酸或其他化合物限制，不论是氨基酸或其他化合物 比如比如磷酸盐磷酸盐 , 都能够成为有利于特定生物过都能够成为有利于特定生物过程的最优控制的技术条件。程的最优控制的技术条件。 虽然延续培育得到的结果阐明，赖虽然延续培育得到的结果阐明，赖氨酸的生成是与细胞的生长是相关联的。氨酸的生成是与细胞的生长是相关联的。但在有效分泌的生理条件下，氨基酸消费但在有效分泌的生理条件下，氨基酸消费菌普通都处于生长受限制的

26、形状。菌普通都处于生长受限制的形状。 然而，对于与生长限制相关的中心然而，对于与生长限制相关的中心代谢代谢 central metabolism 和外围代和外围代谢谢peripheral metabolism 的改动如的改动如何影响氨基酸的有效生成，还不很清楚；何影响氨基酸的有效生成，还不很清楚；这或许与影响到许多不同的基因和支配这或许与影响到许多不同的基因和支配子的调理网络子的调理网络 regulatory networks ) 的作用有关。的作用有关。谷氨酸的消费可以建筑在完全谷氨酸的消费可以建筑在完全不同的细胞代谢态势下。许多方法不同的细胞代谢态势下。许多方法可诱导其分泌，包括生物素饥饿

27、法可诱导其分泌，包括生物素饥饿法用于谷氨酸消费的谷氨酸棒杆菌用于谷氨酸消费的谷氨酸棒杆菌是生物素缺陷型、添加胺类外表是生物素缺陷型、添加胺类外表活性剂、在菌体生长期添加青霉素、活性剂、在菌体生长期添加青霉素、甘油或脂肪酸缺陷菌株在限制条件甘油或脂肪酸缺陷菌株在限制条件下生长等。下生长等。 很显然，所运用的这些很显然，所运用的这些方法都对细胞质膜或细胞壁方法都对细胞质膜或细胞壁有一定影响，但使细胞膜通有一定影响，但使细胞膜通透性发生变化的机理是不完透性发生变化的机理是不完全一样的。全一样的。谷氨酸的分泌曾被以为是由于相谷氨酸的分泌曾被以为是由于相对简单和直接的代谢改动即影响细对简单和直接的代谢改

28、动即影响细胞膜性质的而引起的，然而最近发胞膜性质的而引起的，然而最近发如今没有紧缩效应的大肠杆菌如今没有紧缩效应的大肠杆菌rel A 基因缺损中，经过氨基酸饥饿法可基因缺损中，经过氨基酸饥饿法可以触发细胞的借助于载体的谷氨酸分以触发细胞的借助于载体的谷氨酸分泌活性，这阐明全局调理机制对分泌泌活性，这阐明全局调理机制对分泌的影响是存在的。的影响是存在的。 1.2 氨基酸消费的微生物生理学氨基酸消费的微生物生理学对于经氧化复原过程实现氨对于经氧化复原过程实现氨基酸消费的重要性，早有所认识。基酸消费的重要性，早有所认识。但对其中大多数景象至少在分但对其中大多数景象至少在分子程度上仍未很好了解。对普子

29、程度上仍未很好了解。对普通的代谢调理景象做如下五点概通的代谢调理景象做如下五点概述，能够将有利于我们从生理学述，能够将有利于我们从生理学的角度去了解代谢中间产物的消的角度去了解代谢中间产物的消费。费。 1 氨基酸的消费与菌体生长之间氨基酸的消费与菌体生长之间的关系尚未处理耦合与否？。的关系尚未处理耦合与否？。2 限制生长条件下的微生物生理。限制生长条件下的微生物生理。 在缓慢生长或非生长条件下，有目的在缓慢生长或非生长条件下，有目的地控制基质的吸收与代谢的速率，能地控制基质的吸收与代谢的速率，能提高发酵工业消费效率。因此，要用提高发酵工业消费效率。因此，要用分子技术或生化技术对此进展深化细分子

30、技术或生化技术对此进展深化细致的研讨，以阐明在限制生长条件下，致的研讨，以阐明在限制生长条件下，微生物的生理背景同工业生物过程的微生物的生理背景同工业生物过程的运用必定亲密相关的道理。运用必定亲密相关的道理。3溢出代谢的概念：溢出代谢的概念： 当这个生当这个生理学的新见识同过量消费的特定代理学的新见识同过量消费的特定代谢条件，在分子程度上发生相互关谢条件，在分子程度上发生相互关联的时候，溢出代谢联的时候，溢出代谢overflow metabolism的概念是值得关注的。的概念是值得关注的。 例如，在过量消费某种产物的代谢例如，在过量消费某种产物的代谢条件下，已察看到某些特有的代谢中间条件下，已

31、察看到某些特有的代谢中间产物，如产物，如 丙酮酸、丙酮酸、 - 酮戊二酸等，会酮戊二酸等，会大量分泌。这些特定的代谢中间产物先大量分泌。这些特定的代谢中间产物先在细胞内累积这取决于碳源的性质和在细胞内累积这取决于碳源的性质和生长限制，然后分泌到细胞外假设生长限制，然后分泌到细胞外假设细胞具备允许这些代谢中间产物跨膜机细胞具备允许这些代谢中间产物跨膜机构或有保送系统存在，从而抵消在碳构或有保送系统存在，从而抵消在碳架物质、复原当量和代谢能等在代谢中架物质、复原当量和代谢能等在代谢中的不平衡。的不平衡。4代谢不平衡：代谢不平衡： 细胞的代谢不平衡指碳细胞的代谢不平衡指碳架物质不平衡，特别是指代谢能

32、和复原当量架物质不平衡，特别是指代谢能和复原当量的不平衡。代谢不平衡的条件经常涉及到溢的不平衡。代谢不平衡的条件经常涉及到溢流阀流阀 overflow valves 的功能。现实上，的功能。现实上，代谢网络之所以可以在失去平衡的条件下代谢网络之所以可以在失去平衡的条件下如大量氨基酸的过量合成如大量氨基酸的过量合成 得以维持，得以维持，是由于它具备使通常情况下指碳架物质和是由于它具备使通常情况下指碳架物质和代谢能限制的条件下代谢能限制的条件下 耦合在一同的代谢耦合在一同的代谢流脱钩的灵敏性。流脱钩的灵敏性。 好几个术语，如好几个术语，如 “ 解耦解耦联联 、“ 代谢能溢出代谢能溢出 等就是用来阐

33、明这等就是用来阐明这种灵敏性的。种灵敏性的。 实践上，曾有人这样描画过细实践上，曾有人这样描画过细菌的这种行为：菌的这种行为：“ 可以推断，细菌可以推断，细菌对于代谢能过剩的处理方法是把它对于代谢能过剩的处理方法是把它浪费用掉浪费用掉 。然而，对特定条。然而，对特定条件下如与不生长发生耦合或耦合件下如与不生长发生耦合或耦合欠佳的氨基酸的消费条件下代谢欠佳的氨基酸的消费条件下代谢能耗散的机制，尚待进展深化的研能耗散的机制，尚待进展深化的研讨。讨。 在细菌中存在很多可以浪费代在细菌中存在很多可以浪费代谢能的反响和反响组合。如谢能的反响和反响组合。如 K+ 离子或离子或 NH4+ 的无效循环，在的无

34、效循环，在某些情况下也会发生质子的无效某些情况下也会发生质子的无效循环。这样的代谢能溢出反响阐明，循环。这样的代谢能溢出反响阐明，合成代谢与分解代谢之间存在不平合成代谢与分解代谢之间存在不平衡衡, 而这正是氨基酸消费菌种所希而这正是氨基酸消费菌种所希望得到满足的条件。望得到满足的条件。 其实，关于谷氨酸棒杆菌的赖氨其实，关于谷氨酸棒杆菌的赖氨酸消费的能量溢出问题已有过争论，酸消费的能量溢出问题已有过争论，赖氨酸消费的最大转化率能够遭到过赖氨酸消费的最大转化率能够遭到过量的代谢能的约束。赖氨酸的合成的量的代谢能的约束。赖氨酸的合成的高度添加使代谢发生改动，引起代谢高度添加使代谢发生改动，引起代谢

35、能的过剩。因此，可以以为高的能量能的过剩。因此，可以以为高的能量耗散才干适宜于代谢中间产物如氨耗散才干适宜于代谢中间产物如氨基酸的过量合成。基酸的过量合成。5有关浸透顺应性问题：有关浸透顺应性问题： 在分批培育的条件下，醪液中溶在分批培育的条件下，醪液中溶质碳源和能源的浓度会发生很大质碳源和能源的浓度会发生很大的变化，那么了解和控制有关浸透顺的变化，那么了解和控制有关浸透顺应性的代谢过程显然就相当重要了。应性的代谢过程显然就相当重要了。细胞外部浸透压实践上是水活度细胞外部浸透压实践上是水活度的改动不但对细胞的代谢，而且对基的改动不但对细胞的代谢，而且对基质的吸收、产物的释放都会产生有效质的吸收

36、、产物的释放都会产生有效的影响。的影响。 关于真细菌这方面的根本机制的关于真细菌这方面的根本机制的研讨，能够促使我们去选育已丧失以研讨，能够促使我们去选育已丧失以下两种才干的菌株：下两种才干的菌株： 一是丧失对不利于消费的浸透维一是丧失对不利于消费的浸透维护物质如海藻糖的合成才干；二护物质如海藻糖的合成才干；二是丧失对代谢和保送反响做出浸透压是丧失对代谢和保送反响做出浸透压呼应的才干。呼应的才干。 2. 氨基酸生物合成的代谢流量分析氨基酸生物合成的代谢流量分析 除了代谢途径及其调理机制和除了代谢途径及其调理机制和知途径的化学计量分析以外，稳态知途径的化学计量分析以外，稳态代谢流量和流量动力学分

37、析对于了代谢流量和流量动力学分析对于了解氨基酸消费的代谢网络也越来越解氨基酸消费的代谢网络也越来越重要。重要。 这既涉及到提供碳架物质、这既涉及到提供碳架物质、 氧氧化复原当量和代谢能的中心代谢途化复原当量和代谢能的中心代谢途径，也涉及到那些通往特定氨基酸径，也涉及到那些通往特定氨基酸的合成代谢途径。代谢流量分析和的合成代谢途径。代谢流量分析和代谢流的动力学分析的一个主要目代谢流的动力学分析的一个主要目的在于鉴定代谢网络中所普通以为的在于鉴定代谢网络中所普通以为的限速步骤。的限速步骤。 CO2NADP+NADPH+NADP+NADPH+6-P-GF-6-PFDPDHAPGA-3-P1,3-2P

38、-GA3-P-GA2-P-GAPEPPYRAcCoACTASCAOAAICA -KGScCoAFMAMLAGOAGlcG6P6-P-GARu-5-PX-5-PR-5-PE-4-PSed-7-PPRPPUMPCTPdTMPAMPGMPDNA,RNAATPPR-ATPPR-AMPBBMBBMIGPPRAICIAPHPHOLHisIGlu -KGH2OPiHALNAD+NAHD+NAD+NAHD+GlnGluGlu -KGNADPH+NH3ATPADPADPATPNADPH+NADP+PiATPADPNAD+AspGluArgProCHOTrpPRPP PPiSerGluPREBTyrPheGluG

39、luSerCysS2-SO42-AlaGluGOAGlyAMPGMPPRPPFig. Metabolic Pathyways for the Biosynthesis of Amino AcidsFADH2NADH+GTPCO2NADH+NADH+CO2HisEDAHPGlcPEPPYRASAATPADPAsp-PNADPH+NADP+DDPNADPH+NADP+HseThrIleMetLysIDAPH4DSCAGlu -KGNADPH+NH3SCACO2LysEOrnCitGluAsp -AL -OIVAValGluNADPH+NADP+AcCoALeuGluH2OppspykFppcpck

40、pcodc 主要可经过两种不同的方法定量地、主要可经过两种不同的方法定量地、完好地描画细胞的代谢网络：完好地描画细胞的代谢网络：1描画各步反响酶的动力学属描画各步反响酶的动力学属性及其他有用数据的方法；性及其他有用数据的方法；2直接测定基质、产物及一些代表直接测定基质、产物及一些代表性中间产物的方法，如物料平衡性中间产物的方法，如物料平衡 代代谢物平衡技术。谢物平衡技术。 假设要对代谢网络做出完好描画并假设要对代谢网络做出完好描画并且对各步反响及其代谢物流量的重要程且对各步反响及其代谢物流量的重要程度做出评价，就要弄清每一个酶的的调度做出评价，就要弄清每一个酶的的调理包括对酶的活性的调理和对表

41、达程理包括对酶的活性的调理和对表达程度的调理情况，这当然是不容易如愿度的调理情况，这当然是不容易如愿的，但已被实际证明，以下简化的战略的，但已被实际证明，以下简化的战略也可以用来对代谢流进展定量的描画。也可以用来对代谢流进展定量的描画。 第一种方法，在某些场所下用代谢第一种方法，在某些场所下用代谢控制实际来对有关生物技术学的研讨进控制实际来对有关生物技术学的研讨进展反响动力学的分析。其根本原理就是展反响动力学的分析。其根本原理就是分析酶活力或酶浓度的微量变化对代谢分析酶活力或酶浓度的微量变化对代谢流量及代谢物浓度的影响，进而确定特流量及代谢物浓度的影响，进而确定特定的流量控制系数定的流量控制系

42、数 flux control coefficients ，该系数反映特定反响对，该系数反映特定反响对复杂途径的影响程度。另一种更常用的复杂途径的影响程度。另一种更常用的实际是生化系统实际略。实际是生化系统实际略。 第二种方法，代谢物平衡技术。第二种方法，代谢物平衡技术。其方式的推导建立在对基质、产物及其方式的推导建立在对基质、产物及某些重要中间产物的直接测定上。这某些重要中间产物的直接测定上。这种方法已在谷氨酸棒杆菌生物合成赖种方法已在谷氨酸棒杆菌生物合成赖氨酸的研讨中得到了运用。假设所研氨酸的研讨中得到了运用。假设所研讨的代谢网络的途径构造知，又假定讨的代谢网络的途径构造知，又假定进展稳态代

43、谢，那么就可经过准确测进展稳态代谢，那么就可经过准确测得的一切进出细胞代谢流的流量，推得的一切进出细胞代谢流的流量，推导出特定途径的代谢流量分布。导出特定途径的代谢流量分布。 但用这类方法计算，很难把代谢但用这类方法计算，很难把代谢环路环路 如如TCA环环 、重要节点、重要节点 如如 PYR、 PEP 节点节点 、以及平衡反响、以及平衡反响酶促反响的正向和逆向流量的特酶促反响的正向和逆向流量的特殊重要性包罗在内。这是这类方法的殊重要性包罗在内。这是这类方法的局限性。为了弥补这种局限性，近年局限性。为了弥补这种局限性，近年已有几种技术用到这种类型的分析中已有几种技术用到这种类型的分析中去了。去了

44、。 如采用示踪流量实验如采用示踪流量实验tracer flux experiments 技术、快速取技术、快速取样技术及核磁共振样技术及核磁共振NMR技术技术可获得关于代谢流分布的另外一可获得关于代谢流分布的另外一些信息，些信息， 如代谢网络的有关组成如代谢网络的有关组成部分中的流量分布、部分中的流量分布、 胞内不同代胞内不同代谢产物的累积量，谢产物的累积量， 以及它们各自以及它们各自随时间而变化的情况。随时间而变化的情况。 有人分析了谷氨酸棒杆菌在对数生长有人分析了谷氨酸棒杆菌在对数生长期、赖氨酸消费期生物素量足够及谷期、赖氨酸消费期生物素量足够及谷氨酸消费期生物素限量等条件下胞内氨酸消费期

45、生物素限量等条件下胞内代谢流的不同分布情况代谢流的不同分布情况 以下图，它以下图，它们以们以13C 标志的葡萄糖为碳源进展分零售标志的葡萄糖为碳源进展分零售酵，然后运用酵，然后运用 NMR 测定标志了的代谢物，测定标志了的代谢物，同时运用质量平衡法进展计算，得到了图同时运用质量平衡法进展计算，得到了图中的流量分布图，或称代谢断面中的流量分布图，或称代谢断面 sections of the metabolism 图。图。 GluG6PF6PGA3PPYRR5PCO2OAACO2GOABiomass HMP TCA CO2回补 EMP1005940733852171351810(60)14 154

46、36133A. 对数生长期GluG6PF6PGA3PPYRR5PCO2OAACO2GOABiomass HMP TCA CO2回补 EMP100524783989821341816(80)6 15335215LysCO21216244B. 赖氨酸生成期GluG6PF6PGA3PPYRR5PCO2OAACO2GOABiomass HMP TCA CO2回补 EMP100831731497000322133(25)0 164434411C. 谷氨酸生成期Glu55 由图可见，在不同条件下，由图可见，在不同条件下，流量发生了显著的变化。酵解流量发生了显著的变化。酵解途径的途径的 HMP 旁路的流量分

47、布旁路的流量分布在赖氨酸生成时添加，而在谷在赖氨酸生成时添加，而在谷氨酸生成时那么下降。在氨基氨酸生成时那么下降。在氨基酸分泌的情况下，回补反响变酸分泌的情况下，回补反响变得更重要一些。得更重要一些。 另一个长期以来不能确定的另一个长期以来不能确定的问题也在研讨中得到理处理，也问题也在研讨中得到理处理，也就是氨基酸生成条件下就是氨基酸生成条件下 GOA 环环活力的问题，在氨基酸生成条件活力的问题，在氨基酸生成条件下，下， GOA 环的活力实测是非常环的活力实测是非常低的。低的。 以下图为在不同转化率时的以下图为在不同转化率时的实际流量分布图。实际流量分布图。 G6PF6PPEPPYRAcCoA

48、Ru5PGlcCO2OAALys1001511837982100515303317331158520A. 平衡生长G6PF6PPEPPYRAcCoARu5PGlcCO2OAALys10069499100633512812835B. YLys/Glc=35%G6PF6PPEPPYRAcCoARu5PGlcCO2OAALys100150-5075100-25750075C. YLys/Glc=75%CO2CO2CO25125课外学习参考资料：课外学习参考资料：Metabolic Pathway Synthesis (p288)Metabolic Flux Analysis (p309)in Met

49、abolic Engineering, 1998Metabolic Flux Balance Analysis (p13) in Metabolic Engineering, 1999 3. 基质的跨膜吸收与氨基酸的跨膜输出基质的跨膜吸收与氨基酸的跨膜输出 基质的吸收和产物的输出对于氨基基质的吸收和产物的输出对于氨基酸的生成是非常重要的。对于某些细菌，酸的生成是非常重要的。对于某些细菌，特别是大肠杆菌对基质吸收的不同机制特别是大肠杆菌对基质吸收的不同机制已作了详尽的研讨，但对于其它生物工已作了详尽的研讨，但对于其它生物工程有关的微生物，如谷氨酸棒杆菌的蔗程有关的微生物，如谷氨酸棒杆菌的蔗糖及羧

50、酸的吸收机制那么知之甚少。而糖及羧酸的吸收机制那么知之甚少。而关于产物氨基酸怎样跨过膜而被分泌出关于产物氨基酸怎样跨过膜而被分泌出细胞的问题，似乎或多或少被忽略掉了。细胞的问题，似乎或多或少被忽略掉了。 近年的研讨阐明，在氨基酸消费近年的研讨阐明，在氨基酸消费的条件下，的条件下， “ 氨基酸被动分散跨过细氨基酸被动分散跨过细胞质膜胞质膜 这一想象是武断的。谷氨这一想象是武断的。谷氨酸棒杆菌中至少有谷氨酸、赖氨酸、酸棒杆菌中至少有谷氨酸、赖氨酸、异亮氨酸及苏氨酸，以及大肠杆菌中异亮氨酸及苏氨酸，以及大肠杆菌中谷氨酸和苏氨酸，都是借助于载体的谷氨酸和苏氨酸，都是借助于载体的保送过程，而且不纯粹是被

51、动的。而保送过程，而且不纯粹是被动的。而运动发酵单胞菌运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis的重组菌株中，丙氨酸那么的重组菌株中，丙氨酸那么是依托简单分散机制来分泌。是依托简单分散机制来分泌。 详细了解特定氨基酸跨过细胞质详细了解特定氨基酸跨过细胞质膜浸透屏障的机理，对于提高发酵过膜浸透屏障的机理，对于提高发酵过程的效率和转化率也非常重要。虽然程的效率和转化率也非常重要。虽然采用细菌来消费氨基酸往往可以获得采用细菌来消费氨基酸往往可以获得极高的胞外氨基酸浓度，人们却并未极高的胞外氨基酸浓度，人们却并未认识到这至少部分是由于细胞向载体认识到这至少部分是由于细胞向载体系统所催化的分泌反响

52、提供了代谢能系统所催化的分泌反响提供了代谢能的结果。这一点已被有关赖氨酸和异的结果。这一点已被有关赖氨酸和异亮氨酸分泌的研讨所证明亮氨酸分泌的研讨所证明 。 以下图显示了谷氨酸棒杆菌以下图显示了谷氨酸棒杆菌在异亮氨酸消费过程中发生的不在异亮氨酸消费过程中发生的不同流量。所察看到的异亮氨酸的同流量。所察看到的异亮氨酸的净产量实践上是借助于载体而构净产量实践上是借助于载体而构成的向外分泌的流量、向内吸纳成的向外分泌的流量、向内吸纳的流量及分散流量的代数和。的流量及分散流量的代数和。 在分零售酵的开场阶段，异亮在分零售酵的开场阶段，异亮氨酸从胞内向胞外分散，但随着胞外氨酸从胞内向胞外分散，但随着胞外

53、异亮氨酸浓度的添加，其分散方向也异亮氨酸浓度的添加，其分散方向也发生改动，并越来越多地抵消异亮氨发生改动，并越来越多地抵消异亮氨酸载体系统的分泌作用。酸载体系统的分泌作用。 这一方面解释了所能获得的最这一方面解释了所能获得的最大胞外浓度取决于异亮氨酸对质膜大胞外浓度取决于异亮氨酸对质膜的透性常数，以及分泌和吸收载体的透性常数，以及分泌和吸收载体的活力；另一方面，由此可看出在的活力；另一方面，由此可看出在消费条件下能够发生由代谢能驱动消费条件下能够发生由代谢能驱动的分泌与被动回流构成的无效循环的分泌与被动回流构成的无效循环是浪费代谢能的。是浪费代谢能的。 普通说来，抵消氨基酸的产量的普通说来，抵

54、消氨基酸的产量的氨基酸的吸收系统对于整个过程并不氨基酸的吸收系统对于整个过程并不重要。用谷氨酸棒杆菌消费赖氨酸时，重要。用谷氨酸棒杆菌消费赖氨酸时，吸收系统的活力非常低。最近发现，吸收系统的活力非常低。最近发现，芳香族氨基酸的吸收系统过量表达的芳香族氨基酸的吸收系统过量表达的结果是相应氨基酸的吸收的添加，实结果是相应氨基酸的吸收的添加，实践上产物的转化率降低了。总之，深践上产物的转化率降低了。总之，深化了解氨基酸吸收和分泌的能学及调化了解氨基酸吸收和分泌的能学及调控的机理对于定量地了解氨基酸的消控的机理对于定量地了解氨基酸的消费过程是极为重要的。费过程是极为重要的。 在进展包括保送途径的代谢流

55、量的详细分析时，特别是在比较野生株和消费菌株，或特定菌株在消费或非消费条件下的性质时，已引出了几个重要的概念。 单靠单靠“ 瓶颈瓶颈 酶的过量表达并不酶的过量表达并不能获得理想的高产结果：在通常情况下，能获得理想的高产结果：在通常情况下，仅仅是从基质到产物整条途径的某仅仅是从基质到产物整条途径的某 “ 瓶瓶颈颈 酶的过量表达并不能获得理想的酶的过量表达并不能获得理想的高产结果。对消费菌株的分析阐明，为高产结果。对消费菌株的分析阐明，为了使得特定氨基酸可以稳定而有效地分了使得特定氨基酸可以稳定而有效地分泌，应该对酶和途径进展细致的调整。泌，应该对酶和途径进展细致的调整。只需当一系列酶发生了协调的

56、改动，才只需当一系列酶发生了协调的改动，才干防止细胞内代谢中间产物库的亏空或干防止细胞内代谢中间产物库的亏空或积压，防止代谢不平衡或不用要的副反积压，防止代谢不平衡或不用要的副反响。响。 用谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌和用谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌和酵母菌进展了有关芳香族氨基酸的胜酵母菌进展了有关芳香族氨基酸的胜利的研讨。关于谷氨酸棒杆菌、大肠利的研讨。关于谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌的代谢途径工程研讨的成果已见杆菌的代谢途径工程研讨的成果已见发表。发表。 为提高色氨酸的产量，已对谷氨为提高色氨酸的产量，已对谷氨酸棒杆菌按部就班地进展了一系列的酸棒杆菌按部就班地进展了一系列的遗传调理，包括：色氨酸支配子已遗传

57、调理，包括：色氨酸支配子已被解除调理的的基因的过量表达、被解除调理的的基因的过量表达、去除调理子及弱化序列的控制；切断去除调理子及弱化序列的控制；切断通往苯丙氨酸和酪氨酸的支路、添加通往苯丙氨酸和酪氨酸的支路、添加前体物如前体物如 PEP、E-4-P和丝氨酸等的供和丝氨酸等的供应、破坏色氨酸酶的降解色氨酸的活应、破坏色氨酸酶的降解色氨酸的活性等等。性等等。HMPEMPPEPE4PDAHP莽草酸分支酸预苯酸邻氨基苯甲酸PheTyrTrpPRPPSer降解产物大肠杆菌中色大肠杆菌中色氨酸合成途径氨酸合成途径的简图的简图该图略去了酶该图略去了酶活力及基因表活力及基因表达程度上的调达程度上的调控机制，

58、实践控机制，实践上在消费菌株上在消费菌株中，这些调控中，这些调控机制都已被解机制都已被解除。除。 虽然普通用于芳香族氨基酸消费虽然普通用于芳香族氨基酸消费的微生物并不是酿酒酵母，但在概念的微生物并不是酿酒酵母，但在概念讨论方面，用酵母进展的色氨酸生物讨论方面，用酵母进展的色氨酸生物合成的研讨是引人关注的。实验结果合成的研讨是引人关注的。实验结果阐明，即使在无分支的途径中，想靠阐明，即使在无分支的途径中，想靠单个酶单个酶 “上调上调up-modulation，添加整条途径的流量往往是无济于事添加整条途径的流量往往是无济于事的。的。 正如基于流量控制实际的实正如基于流量控制实际的实际解释，只需几种

59、酶活性协同地提际解释，只需几种酶活性协同地提高，才有能够大幅度添加流向色氨高，才有能够大幅度添加流向色氨酸的全程的流量。这个发现为许多酸的全程的流量。这个发现为许多途径中的关于途径中的关于“分摊式的代谢控制分摊式的代谢控制distributive metabolic control的更加笼统的描画提供了支持；的更加笼统的描画提供了支持；同时也对仍在广泛运用的代谢途径同时也对仍在广泛运用的代谢途径的所谓的所谓“瓶颈识别方法做出了一瓶颈识别方法做出了一个重要的限制。个重要的限制。 4. 氨基酸消费的代谢设计氨基酸消费的代谢设计 氨基酸消费上广泛运用棒状杆菌，这一方面有历史的缘由；另一方面，与其他微

60、生物如大肠杆菌相比较，棒状杆菌在工业消费上具有明显的优势。 棒状杆菌的代谢调理相对简棒状杆菌的代谢调理相对简单。肠道细菌中特定反响的酶及单。肠道细菌中特定反响的酶及特定基质的载体系统具有多重性，特定基质的载体系统具有多重性，而棒状杆菌中那么没有；棒状杆而棒状杆菌中那么没有；棒状杆菌的代谢调控方式也比大肠杆菌菌的代谢调控方式也比大肠杆菌要简单得多。然而，利用肠道细要简单得多。然而，利用肠道细菌进展氨基酸菌种的育种的优势菌进展氨基酸菌种的育种的优势那么在于可以方便地运用成熟的那么在于可以方便地运用成熟的现代现代 DNA 重组技术，有效地进重组技术，有效地进展氨基酸消费菌种的改造。展氨基酸消费菌种的