周凌云茶炭疽病的分子检测及病原鉴定

1、茶炭疽病的分子检测及病原鉴定周凌云 王沅江 黄安平 曾振 刘红艳 （基金项目：湖南省农业科学院创新项目湖南省茶叶研究所，长沙 410125）摘 要：根据茶炭疽病菌与其它菌ITS序列的差异设计了1 对寡聚核苷酸引物，并优化DNA抽提方法与扩增条件，从而实现了病叶准确而快速的PCR 检测。分离到两种病原菌Z1、Z2通过形态鉴定与回接实验初步鉴定为茶炭疽病菌，并在核酸体转录间隔区序列（GITS、ITS）及肌动蛋白基因（ACT）3对引物的多基因分子联合检测实验中再次被证实。关键词：茶炭疽病；分子检测；病原；鉴定；症状Molecular Detection and Pathogen Identifica

2、tion of Tea AnthraxZHOU Lingyun, WANG Yuanjiang, HUANG Anping,ZENG Zhen,LIU Hongyan Hunan Tea Research Institute，Changsha 410125 Abstract：According to the sequence of internal transcribed spacer regions ( ITS) of the ribosomal gene，a pair of specific primers for the pathogen of Tea anthracnose was s

3、ynthesizedWith the optimization of reaction conditions and amplification Study,we provided a accurate and rapid method to detect the pathogen. Z1、Z2 were isolated and been preliminary identified as two different pathogens of tea anthracnose by morphological identification and tie back experiment,The

4、 conclusion was testified again by molecular detection of three primes(General ITS, ITS and Actin gene gene).Key words: Tea anthracnose；Molecular detection；Pathogen；Identify；Symptom 茶炭疽病是我国各茶叶产区常见病害之一，在茶叶上可产生1/3左右的灰白或红褐色病斑，往往造成5%以上的减产，干茶外形破碎、滋味变淡。其病原菌从茶树嫩叶背面入侵，潜伏5-20天，病症与茶云纹叶枯病、褐色叶斑病等叶部病害混淆，因此，以形态特征

5、为基础的常规病害诊断技术难以及时准确检测到茶炭疽病的发生，从而导致该病难以得到及时高效的防控，自2009年，本研究组建立了茶炭疽病原菌的PCR鉴定方法后1，再次进行自然病样的直接分子检测，并分离获得两种菌落形态差异很大的病菌，分别命名为Z1、Z2，经过形态学与分子鉴定明确Z1、Z2为茶炭疽病的致病菌。1 材料与方法1. 1供试病叶及来源长沙县茶园随机采集20片显症为红褐色病斑的茶叶与20片显症为灰白色病斑的茶叶。1.2 病原菌分离、回接与形态学观察选取病叶病健交界处组织100块，约2mm×2mm，75%酒精中浸泡5秒钟，3%次氯酸钠溶液灭菌1分钟，无菌水洗3次，置于PDA培养基上，放

6、入28培养箱中培养，单孢分离得到纯孢子培养于PDA上，记录病原菌的菌落形态、分生孢子的形状、颜色、大小等。借鉴Yoshida，K，20042的接种方法，利用打孔器将PDA上培养5天的菌落打成菌碟，置于挑针戳了2个伤口的茶叶上，脱脂棉蘸无菌水保湿，分别接种于室内的ROOTCUBES®生长介质(Smithers-Oasis有限公司)中保持高湿、26与田间枝条茶叶上用保鲜袋连续保湿3天，设置3个重复，对照接无菌培养基，其他操作相同，每天观察1次发病情况，将已产生症状的叶片进行切片棉兰染色观察。1.3 病原菌分子生物学鉴定根据茶炭疽病菌与其它菌属ITS序列的差异，应用DNAStar的Prim

7、erSelect设计了1个ITS引物对，与来自文献3-4的GITS 、ACT的这2个引物一起交付华大生物有限公司合成，3个引物对见表1。表1 选择的目标基因及相应的引物名称引 物GITSITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGCITSITSF：TTACGTCCCTGCCCTTTGTA，ITSR：AATGTGCGTTCAAAGATTCGACT512F：ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC，783R：TACGAGTCCTTCTGGCCCAT分别应用TIANGEN公司植物基因组DNA抽提试剂盒与真菌基因组DNA试剂盒提取自然发病叶片的DN

8、A，而对于Z1、Z2的DNA抽提则采用其真菌基因组DNA试剂盒。以提取的DNA为模板，用3对引物扩增DNA序列，利用宝生物公司pMDTM19-T载体进行PCR产物的克隆，方法参照pMDTM19-T载体说明书。选择插入片段长度与克隆片段长度一致的克隆，送交华大生物公司测序分析。将测定所得序列利用Blast程序从GenBank搜索相关序列，进行同源性比较。2结果与分析2. 1 明确两种茶炭疽病症茶炭疽病主要发生在茶树成叶或老叶上，病斑近圆形或不规则形，初期水渍状暗绿色，最后呈红褐色或灰白色，病斑上生有细小的黑色粒点，病斑可扩大到叶片的1/2以上，病健分明，见图1A、1B。图1A 茶炭疽病红褐色病斑

9、 图1B 茶炭疽病灰白色病斑22 分离到两种病原菌100块红褐色病样分离到Z1的几率为50.00%、Z2为5.12%，100块灰白色病样分离到Z1的几率为73.33%、Z2为3.20%。Z1在PDA上生长速率平均为1.82cm/d,菌落颜色逐渐由白色转变为灰白直至灰黑。显微镜下菌丝体附着胞黑褐色，棍棒状、掌状或三角形，边缘整齐，大小为(8-12)um×(7-20)um，见图2A、2B。 Z2在PDA上生长速率平均为1.25cm/d。菌落红褐色，后期菌落表层长出一些黄色及白色絮状物，20天左右可形成分生孢子，分生孢子单胞、无色、壁光滑，圆柱形，两端钝圆，有油球，大小为(15-24 )u

10、m×(8-12)um。而由病原菌的形态特征初步鉴定Z1、Z2均为茶炭疽病原菌，见图3A、3B。图2A Z1菌落（6天） 图2B Z1附着胞（10×60倍） 图3A Z2菌落（30天） 图3B Z2分生孢子（10×60倍）2.3 柯赫氏法则验证Z1、Z2进行菌碟回接实验，6天左右即在接种茶叶上形成病斑，病斑缓慢扩大，呈褐色，对照伤口没有病斑显现，见以下图4A、4B。选取Z2接种显症处进行切片棉兰染色观察，与Z2菌落中分生孢子大小形态一致，见图4C。图4A回接Z1显症 图4B回接Z2显症 图4C回接Z2显症切片2.4 建立茶炭疽病叶的分子检测方法通过多次参数优化，最终

11、明确PCR的参数分别为：PCR 扩增的程序为: 95 变性3 min; 94 变性1 min，54 退火45 s，72 延伸1. 5 min，35个循环; 最后72延伸10 min。各样品的PCR产物能获得相对单一的电泳条带。见下图5A、5BM 1 2 3 4 M 1 2 3 4 5 图5A 抽提DNA电泳图 图5B PCR产物电泳图谱M:Marker 5000； M:Marker 2000；1：Z1抽提DNA(真菌试剂盒)； 1:病叶-GITS-真菌试剂盒（498bp）；2: Z2抽提DNA(真菌试剂盒)； 2：Z2- ACT (244 bp)；3: 病叶抽提DNA(植物试剂盒)； 3：Z1

12、- GITS（549 bp）；4: 病叶抽提DNA(真菌试剂盒)； 4：Z1-ACT（250 bp）；5：病叶-ITS-植物试剂盒（437bp）图5C 5个测序产物的进化树构建将5个测序结果在GENBANK中比对后，应用DNAStar中phylogenetic tree程序构建的系统进化树显示：病叶与Z1及Z1与Z2分别与Colletotrichum sp、Discula theae-sinensis同源性较高，而Discula是Colletotrichum的更名5。但是通过植物DNA抽提试剂盒获得病叶DNA其PCR产物却与茎点霉属phoma同源率很高，茎点霉属在茶叶中分离率达40%以上，而且

13、产孢量很大，因此应用植物DNA抽提试剂盒更易分离到产孢丰富的茶叶内生茎点霉属。 3 结论和讨论一是建立了一种病茶炭疽病叶的快速分子检测技术，只需花费1天左右的时间。其中真菌抽提试剂盒及ITS引物的应用是快速分子检测的关键因素。但本试验结果只能定性的检测茶炭疽病菌的有无，尚不能进行定量测定。还需继续优化条件，并采用实时定量PCR 技术可准确计算出病组织中病原菌的含量，将更有利于扩增在潜伏早期的茶炭疽病，由于病样间发病程度的差异， 本试验中检测病样扩增到的病样DNA特异性条带强弱有所差异，因此在实际检测的过程中，需要检测多份样品，以提高诊断结果的准确性。二是从显症茶白星病叶中分离到Z1、Z2两种真

14、菌，通过柯赫氏法则及分子检测明确均为茶炭疽病菌。炭疽菌属的形态鉴定，形态结构上附着胞是真菌营养菌丝形成的变态结构6，Sutton一直主张应用菌丝体附着胞作为炭疽菌属的分种的形态特征之一7，因此Z1的形态鉴定通过附着胞从而得到初步鉴定。根据ITS许多炭疽菌属系统发育鉴定的主要区域，尤其在新种的研究发表中均采用ITS序列8-9。因此此次炭疽菌属的分子鉴定中采用了2个ITS引物对进行PCR扩增。据报道，茶炭疽菌是茶叶中一种主要的内生菌10，因此Z1、Z2的致病性通过严格的柯赫氏法则的切片验证，12天后在叶片上显症，并分离观察到病原孢子在茶叶中的分布，从而明确其为茶炭疽病菌的两种病原菌。三是进一步验证

15、Discula为最新更名的茶炭疽病菌。Moriwaki J, Sato T首次形态学与分子方法明确茶炭疽病菌的病原属于半知菌亚门，黑盘孢目，盘长孢属，应当为Discula theae-sinensis(Miyake) Moriwaki&sato以取代Colletotrichum theae-sinensis Miyake，本次多基因联合分析中发现Z1的序列在比对时分别与Discula及Colletotrichum高度同源。四是明确茶炭疽病的病原菌具有两种，推测可能更多，从而与在茶叶上不同症状表型相关。而炭疽菌属中绝大多数种不存在寄主专一性，存在较多的一种植物被击中炭疽菌同时寄生，如辣椒

16、可被三种不同种的茶炭疽病C.truncatum ,C.gloeosporioides,C.simmondsii11。Z1、Z2尚需做进一步寄主范围的研究，明确其属于茶叶专一寄生菌或多作物寄生菌。参考文献1. 周凌云, 李静, 王沅江. 茶炭疽病菌的分离、培养及PCR检测J. 福建茶叶, 2009, 32(3): 11-12.2. Yoshida, K. Takeda, Y. Assay method for screening of tea plants with resistance to anthracnose caused by theae-sinensis by use of nove

17、l wound-inoculation. JCAB Abstracts Bulletin of the National Institute of Vegetable and Tea Science; 2004. 3, 137-146.3. White TJ， Bruns T， Lee J， Taylor J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis MA， Gelfand DH， Sninsky JJ， White TJ (eds)

18、， PCR protocols: a guide to methods and applications: 315-322. Academic Press，San Diego，California，USA.4. Carbone I， Kohn LM. 1999. A method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes. Mycologia 91: 553556.5. Moriwaki J, Sato T. A new combination for the causal agent

19、 of tea anthracnose: Discula theae-sinensis (I. Miyake) Moriwaki & Toy. Sato, comb. novJ. Journal of General Plant Pathology, 2009, 75(5): 359-361.6. 许志刚.普通植物病理学(第三版)M.北京：中国农业出版社, 2008,27.7. Sutton B C. The Coelomycetes. Fungi imperfecti with pycnidia, acervuli and stromataM. Commonwealth Mycological Institute., 1980.8. Crouch J