实验六 小鼠脾细胞培养

1、实验六 小鼠脾细胞培养【实验目的】1.了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。2.学习细胞计数、营养液的配制等，初步掌握无菌操作方法。【实验原理】(一) 细胞原代培养原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环

2、境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。(二) 细胞死活鉴定 死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括：死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用

3、了这一性质。台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。除此之外，还有一些细胞器的专有染料。如液泡系的专有染料中性红。中性红是一种

4、低毒性染料，可以使活细胞液泡着红色，而细胞质和细胞核不被着色；死细胞的液泡不被着色或浅染，染料弥散于整个细胞中，细胞核和细胞质被染成红色。有时侯为了增加染色效果可以将两种染料结合使用，如甲基蓝-中性红混合染色法。【实验器材】剪子，棉球，75%酒精，移液枪，无菌操作台，正置光学显微镜，倒置光学显微镜， 解剖盘，滴管，离心管，离心机，注射器，Eppendorf管，培养皿，酒精灯，塑料培养皿，载玻片，盖玻片，血细胞计数板等。【实验材料】小鼠1只，细胞培养液（含生长因子），Trypen Blue染液，PBS缓冲液【实验步骤】(一) 细胞的原代培养1.取材： 取小白鼠一只，采用断头法处死；清水洗小鼠并浸

5、于75%酒精中灭菌3分钟。取出转入超净洁净台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔。取出脾脏，去除其周围的脂肪组织，镊起脾脏用PBS液自上而下冲洗12次。转入无菌玻璃培养皿中，待用。2分离脾细胞： 用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，再用“L”型针头注射器在皿中吸取PBS液0.2ml，然后将其沿脾长轴方向注射入脾内（使脾脏膨胀以利于细胞散开）。 用针尖在脾脏上扎眼，并用“L”针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS液冲脾脏并吹散刮出的脾细胞，稍倾斜并静置12分钟。 吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppendorf管，并使量至1ml，以3000转/分离心12分钟。3培养脾细

6、胞： 超净洁净台中取塑料培养皿一个，用“枪（1ml）”加入细胞培养液2ml，并在皿盖上画上标记，待用。 取上述离心后的Eppendorf管，在超净洁净台内开盖弃去上清液，用“枪（200l）”吸取塑料皿中的培养液400ml加入弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200ml脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37、5%CO2培养箱中培养。 (二) 细胞死活鉴定及计数1. 试剂配制：用生理盐水配成5%Tyrpen Blue染液，备用。2. 染色计数：取0.5mL细胞悬浊液放入试管中，加入1-2滴染液。混合。2-5min后将细胞放在血细胞计数板上观察死活情况

7、，注意不要有气泡产生，放大倍数为10x10。染色后活细胞不着色，死细胞显示蓝色。注意染色时间不能超过15min，否则染液将细胞毒杀。3. 计数：在10x10倍的显微镜下观察，计算血细胞计数板的4个4小方格的细胞数量。包括细胞总数与死细胞数量。压线者计上不计下，计左不计右。图1.血细胞计数板示例图4. 根据染色结果计算活细胞率：依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公式计算细胞存活率：【注意事项】 1、严格进行动物消毒，需用75%酒精消毒。2、严格进行无菌操作，防止细菌、霉菌、支原体污染，避免化学物质污染。3、吸取液体前，瓶口和吸管硬行火焰消毒；吸取液体时，避免碰撞

8、。4、离心管入台前，管口、管壁应消毒。5、实验者离开超净台时，要随时用肘部关闭工作窗。6、器材使用时既要注意用火焰消毒，又要防止烫伤、烫死细胞。【实验结果】本次试验中计数所用材料为培养1-2周后的小鼠脾细胞，培养液呈粉红色，且未被染菌，说明原代细胞培养过程中小鼠脾细胞得到增殖，部分营养物质和其生存所必须的物质被消耗掉。本次试验采取的是Tyrpen Blue染液，活细胞不会被染色而呈无色，死细胞会被其染色而呈蓝色，在光学显微镜下以1010的倍数来观察得细胞总数和活细胞数，可由公式计算出细胞活力。图2. 细胞培养图片图3.细胞染色后图片（10x10）每毫升液体中的细胞数目=(336/5)*25*10000=1.68*107（个）【分析与讨论】本次实验中我们小组所测细胞活力为19.05%，并不算高，分析得应有以下原因可能影响实验结果（包括误差）：a) 若在无菌操作的过程中操作不规范，导致染菌，会极大的影响观察，导致实验失败；b) 若在离心分离呈单细胞的过程