凋亡调节因子与药物耐受性

1、凋亡调节因子与药物耐受性肿瘤细胞对化疗药物的耐药性是临床化疗失败的重要原因。本文综述细胞凋亡调节因子p53、bcl-2、bax等对肿瘤细胞耐药机制的影响和p53蛋白等对P一糖蛋白和多药耐药相关蛋白表达的调节作用，并介绍部分多耐药性新的研究进展。放疗和化疗对肿瘤细胞有明显杀伤作用。然而成功治疗的一个重要障碍是肿瘤细胞对上述治疗无反应，并出现耐受细胞群，导致恶性肿瘤复发或浸润进展。因此了解细胞对化疗药物耐受基础成为许多实验研究的热点。一般而言，研究的重点是解释治疗因子怎样达到细胞内靶位点，并检查药物与靶位点相互作用的分子基础，如高水平表达MDRI基因能够限制多种药物在细胞内的浓度，并引起多耐药性（

2、MDR）。最近几年里，探索和了解细胞凋亡机制，对肿瘤细胞获得或失去耐受细胞毒性机制有了新的认识。1 凋亡调节因子对耐药性的调节作用许多药物能诱导细胞凋亡，包括抗代谢药、脱氧核苷酸合成抑制剂、DNA拓扑异构酶抑制剂、烷化剂及干扰微管药物等1。化疗药物引起凋亡的过程还不十分清楚，可能是药物打断了正常的细胞生长周期所致2。凋亡是一种可以被激活或抑制的可调节过程，因此可能还有在某些情况下药物耐受性的新解释。1.1 p53野生型p53（wt-p53）在细胞生长过程中以“分子警察”身份监视细胞内DNA状态，当DNA受损后，p53通过转录后稳定机制抑制细胞停留在G1期，使细胞有时间修复，若修复失败，wt-p

3、53将角发细胞凋亡。wt-p53缺乏或发生突变，将失去“分子警察”作用，不能诱导受损细胞凋亡，而使受损细胞得以生存。但由于细胞失G1期细胞周期检查点的DNA损伤监视作用，易造成诸如缺失、扩增和易位等染色体畸变。Malcomson3采用温控p53表达载体转染鼠胚胎成纤维细胞株，在鬼臼乙叉甙（VP-16）作用下，32条件时，wt-p53表达，细胞滞留在G1期，明显表现出对药物介导凋亡的耐受性；而在37时，表达突变型p53，细胞在VP-16作用下，无明显生长抑制，继续增殖，并显示出剂量依赖性的细胞凋亡增多。提示wt-p53能介导细胞对VP-16的耐受性。wt-p53介导的耐药性可能与药物作用特点有关

4、。VP-16为细胞周期特异性药，主要作用于细胞周期的S期，干扰DNA的合成。一定剂量的VP-16作用细胞后，wt-p53使得细胞滞留在G1期而不继续增殖，因此，VP-16作用的靶位点减少，如同Topo酶含量下降介导的耐药性一样，引起细胞对VP-16的耐药性。Wosikowski4检测13例对阿霉素（ADM）、长春花碱、顺铂（CDDP）、VP-16和胺苯丫啶等耐药的乳腺癌细胞株，仅1例发生p53基因突变。但许多学者认为低浓度化疗药物可引起表达wt-p53的细胞凋亡，在缺乏wt-妇生基因突变后，须大剂量药物方能引起细胞死亡5、wt-p53的缺失或突变间接导致了药物耐受性。Lowe6通过体内实验发现

5、，表达Wt-p53基因的肿瘤细胞在经放射性和ADM治疗后，绝大多数细胞发生凋亡；相反，相同因子治疗p53基因缺陷的肿瘤细胞MEFS，对放疗和几种化疗药物有较强的耐药性。但将wt-p53基因转染到MEFS细胞，低剂量放疗，或小剂量的ADM、VP-16等药物处理后细胞迅速凋亡。另有报道wt-p53能促进体外培养的人粘液表皮样癌细胞凋亡。p53对细胞耐药性的调节可能是双向的，具体作用方式可能与细胞种类、状态及药物作用特点和剂量有关。如突变型p53可能更多引起细胞对细胞周期非特异性药物耐受，而wt-p53介导细胞对某些细胞周期异性药物耐受。1.2 Bcl-2家族一些研究发现bcl-2基因家族蛋白表达水

6、平变化，能显著改变肿瘤细胞株对化疗药物诱导凋亡的阻抗。Dole7用bcl-2表达载体转染人类神经母细胞瘤细胞株Shep-1，发现高表达bcl-2克隆的细胞株对CDDP和VP-16引起的细胞毒性呈剂量依赖性阻抗。Miyashita1采用基因转染方法，发现bcl-2能使细胞增加对地塞米松、氨甲喋呤、阿糖胞苷、长春新碱（VCR）、VP-16和CDDP等药物耐受性。与对照组细胞相比， bcl-2蛋白并不影响药物对肿瘤细胞增殖的抑制作用，但在维持细胞存活中起着重要调节作用。在VP-16和CDDP等化疗药物去除后，bcl-2蛋白能够重新启动细胞增殖，使细胞获得耐药性。Pantazis8研究VCR诱导人白血

7、病细胞株U-937/WT形成VCR耐药细胞亚株U-937/RV，在U-937/WT细胞中不能检出凋亡抑制蛋白bcl-2和bcl-xl表达，而在U-9377/RV均可检出；但在U-937/RV中亦可检出bax蛋白表达，后者是一种凋亡启动因子，是一种bcl-2蛋白的异源二聚体，可抵销bcl-2的活性作用，而在敏感株中未检出bax蛋白。由此可见bcl-2家族在细胞耐药过程中的作用也是相互调节和相互制约的。1.3 p53与bcl-2家庭间的相互影响细胞凋亡是一个多因子参加的复杂的生理过程，药物影响能诱发p53和bcl-2等蛋白发生一系列变化，参与细胞的耐药性。Miyashi9研究发现wt-p53能与b

8、cl-2基因上p53依赖性的负反应元件结合抑制bcl-2的表达。Eliopoulos10检测p53和bcl-2蛋白在敏感和耐药的卵巢癌细胞株中表达水平，结果显示耐药株过度表达p53和bcl-2蛋白，且bcl-2作用环节可能在p53之上。许多临床资料亦发现突变型p53和bcl-2蛋白的高表达与不良预后有关。Ju11将wt-p53传染wt-p53阴性的HL-60细胞形成转染株SN3，与母代细胞相比，对化疗药物的敏感性明显增加，如对CDDP和胸苷（thymidine）的敏感性分别增加2倍和50倍；而用突变型p53传染的细胞无比现象。用胸苷合成酶抑制剂FdUrd观察与p53相关联基因表达变化，在各种浓

9、度的FdUrd存在下，很大比例的SN3细胞发生凋亡，而不是停留在S期。母代细胞有不确定的bax水平和高水平的bcl-2表达。在SN3细胞bcl-2检测不出，并维持适当基础水平的bax。FdUrd治疗后，wt-p53和bax水平增加，但bax诱导早于p53，且平行出现细胞凋亡的DNA条带。Perego12检测p53与顺铂导致耐药性间的关系时，发现在卵巢癌药细胞株中，突变型p53失去激活bax基因转录能力。这些资料说明p53、bax-2和bax等凋亡调节因子在肿瘤细胞的耐药机制中起重要作用，但作用方式是复杂多样的。2 p53对耐药蛋白的调节作用p53具有不同结构区域。wt-p53与DNA共有区结合

10、后，能正向调节一系列下游基因的表达。另外，wt-?负向调节许多缺乏wt-p53共有区结合位点基因，包括DNA topo、MDRI、c-fos和其它病毒和细胞的启动子。2.1 p53对多药耐药相关蛋白（MRP）表达的调节转录因子spl是MRP基因启动子的强激动剂，wt-?与spl结合，消除spl作用，从转录水平调节MRP表达。Wang13将带有虫荧光素酶标记报告基因的MRP启动子与wt-p53共同转染p53阴性的人类非小细胞肺癌细胞株H1299和鼠（10）1细胞，结果显示wt-p53能呈剂量依赖性地显著抑制MRP启动子活性，wt-忍气吞声作用位点为-91到 103bp，该处有数个spl结合位点；

11、而突为型p53只有很弱的作用。同时研究还发现wt-p53还能抑制高表达MRP的CEM/VM-1-5细胞的内源性MRP表达。Oshika14采用免疫组化技术检测107例非小细胞肺癌标本，MRP和突变型p53表达有明显相关性，双染色技术显示p53和MRP在一些细胞上同时表达，这些病人预后明显罗无MRP和突变型p53患者差。2.2 p53CF p-糖蛋白（P-gp）表达的调节P-gp是有MDR1基因编码的多药耐药蛋白。wt-作用于MDR1下游启动子，从转录水平P-gp的表达。Straussp15将wt-p53与由MDR1下游启动子控制的报告分子共同转染BHK和Sacs-2细胞株，发现wt-p53呈剂

12、量依赖性MDR1基因启动子活性。Strauss16在另一 研究中发现部分p53的突变体能激活MDR2基因下游启动子转录活恪，他将这种p53突变称为“获得功能性突变”。Linn17采用双重免疫组化染色，核p53聚集和P-gp表达经常发生在同一肿瘤细胞，且这种情况在浸润进展期的乳腺癌中更易见到。其推测共同表达突变型p53和P-gp属于一系列分子事件，能导致肿瘤浸润、药物耐受，产生不良预后。3 其它凋亡调节因子对耐药蛋白的调节作用Bcl-2与P-gp作用尚不明确，但Eid20采用免疫组化分析70例人睾丸肿瘤Bcl-2和P-gp表达，Bcl0-2和P-gp存在明显的相关性（P=0.004）。C-myc

13、癌基因为一种参与细胞分化和恶性增殖的核蛋白型癌基因，具有促使DNA复制的功能，可在一些致癌因素作用下（如病毒、放射性和化学诱变剂）发生基因重排和扩增而得以活化。C-myc基因表达既可促进细胞增殖又可促使细胞凋亡，这种相互对立的作用受生长因子等调控。C-myc与P-gp的关系还不清楚，但有报告采用Southern印记杂交分析，发现同一恶性脑胶质瘤细胞发生C-myc基因重排及MDR1基因限制性片段扩增现象，推测C-myc基因活性MDR1基因的变化和脑胶质瘤耐药株的耐药性可能存在较为密切的关系。但另一作者采用免疫组化方法研究67例胃癌标本中p53、C-myc和P-gp的表达，P53的异常表达与P-g

14、p表达呈显著正相关（r-0.63,P0.05）,C-myc和P-gp的表达无明显相关。N-myc也编码一个调节转录的核酸化蛋白。N-myc基因的扩增与MRP表达增加有关。Bordow19采用Rt-PCR观察25例神经母细胞瘤标本，N-myc基因扩增的标本，MRP基因表达水平亦明显增高（P=0.0016），而MDR1基因表达与N-myc癌基因扩增无明显关系。采用N-myc癌基因抑制剂RA研究神经母细胞瘤细胞株SH-SYSY和BE（2）-C，RA抑制N-myc基因表达后，MRP表达随之下降（P-=0.0017），而MDR1基因表达量却增加（P0.05）。Norris20分析60例原发性神经母细胞瘤

15、标本，亦发现在N-myc扩增的肿瘤，MRP表达水平明显增（P0.001）。Kopnin2分析人ras基因对MDR1mRNA和P-gp表达影响。ras基因除能激活外源性MDR1基因启动子外，还能引起内源性MDR1mRNA水平升高，P-gp活性增加并使Rhodamine123外排增多，细胞对秋水仙素和其它一些化疗药物的耐药性亦增加。Chin22研究发现人MDR1基因启动子也是ras癌基因的靶位点，虽然其产物对MDR1基因的正向调节是非特异的，但与突变型p53有协同作用，而wt-p53无此作用。4 多药耐药性研究进展最近研究资料发现耐药蛋白的表达与其启动子甲基化状态有关。Nakayama23采用定量

16、Rt-PCR检测42例急性白血病标本，发现MDR1基因启动子上CpG位点甲基化状态与MDR1基因表达呈负相关。推测MDR1基因表达的必须条件。Kantharids24在T细胞白血病细胞株，采用甲基化敏感和甲基化不敏感的限制酶进行Southern杂交分析，MDR现象与MDR1基因5端去甲基化明显相关。采用去甲基化因子5一氮脱氧嘧啶治疗P-gp表达阴性和阳性细胞株消除MDR1mRNA表达，可增加细胞对表柔比星（daunomycin）的耐受性。另外一些研究发现非细胞毒性剂量的一些基因毒性药物，特别是DNA交联因子，优先改变可诱导的基因表达，这些作用主要发生在转录水平并引起暂时时性的DNA损伤。Ihu

17、at25发现DNA烷化剂丝裂霉素C能明显MDR1mRNA及P-gp表达，并减少药物外输，对ADM耐受性减少到5到10倍。亚细胞毒性的CDDP也有此功能。在单层和球形培养的人和啮齿动物的结肠癌、乳腺癌、白血病、神经母细胞瘤和肝癌细胞株都观察到此现象。Kimsh26研究发现MDR1基因启动子含有热休克应答元件，能与热休克反应元件结合，采用榭皮素（quereetin）抑制热休克应答元件与应答因子间的结合，能逆转MDR1介导的耐药性。由于细胞凋亡的相关调节因子介入多药耐药机制，使得肿瘤细胞对化疗药物耐受机制更加错综复杂。因此，在肿瘤细胞耐药性研究中，应从多角度、全方位考虑，才能制定出罗好的治疗方案。另

18、外，对凋亡调节因子介导耐药机制的研究，可通过加强诱导细胞凋亡的途径克服耐药性。为恶性肿瘤的基因治疗提供一些实验依据。参 考 文 献1 Miyashita T and Reed J Bolld,1993;81:1511572 Huschtscha L,Bartier WA,Eoss CE,et al.Br J cancer,1996;73:54603 Malcomson RDG,Oren M,Wyllie AH,et al.Br J cancer,1995;72:9529574 Wosikowski K,Regis TJ,Robey RW,et al.Cell Growth differ,199

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