(五)青霉素发酵培养基正交优化试验

1、（五）青霉素发酵培养基正交优化试验一、实验目的1、掌握培养基的原理2、了解培养基优化的原理和试验设计方法3、通过实验确定青霉素发酵的较适培养基二、实验原理一）、掌握培养基的原理1. 碳源、氮源 许多碳源和氮源都是复杂的有机物大分子,如淀粉、黄豆饼粉等,用这类原料作为培养基时,微生物必须要具备分泌胞外淀粉酶和蛋白酶的能力,但不是所有的微生物都具备这种能力的. 相应的酶水解/葡萄糖:成本高2. 代谢的阻遏和诱导 碳源、氮源:根据微生物的特性和培养的目的,注意快速利用的碳(氮)源和慢速利用的碳(氮)源的相互配合 葡萄糖:具体利用葡萄糖产生的分解代谢产物会阻遏或抑制某些产物合成所需的酶系的形成或酶的活

2、性. 氮源的诱导或阻遏:蛋白酶类,受培养基中蛋白质或多肽的诱导,而受铵盐、硝酸盐的阻遏;应以有机氮源为主3. 合适的C 、N比碳氮:显著影响微生物生长繁殖和产物合成.氮源:过多,菌体生长过于旺盛,pH偏高,不利于代谢产物的积累;不足则菌体繁殖量少,从而影响产量碳源:过多则容易形成较低的pH;不足则容易引起菌体的衰老和自溶.碳氮比:菌丝体生长阶段氮源需求高;孢子生长阶段氮源需求低. 100:(0.22.0)4. pH的要求 微生物在利用营养物质后,由于酸碱物质的积累或代谢酸碱物质的形成会造成培养体系的pH的波动.因而在配制培养基选取营养成分时,除了要考虑营养的需求外,还要考虑其代谢后对培养体系p

3、H缓冲体系的影响二)培养基优化的原理和试验设计方法1.培养基优化的基本原理 一个批发酵(流加发酵):可以分为生长期和产物形成期两个阶段.第一阶段:控制菌体的生长,目的是使长好的菌体能够处于最佳的产物合成状态,即如何控制有利于微生物催化产物合成所需酶系的形成.第二阶段:控制产物的合成;找出影响反应速度变化的主要因素并加以控制使产物的形成速度处于最佳或底物的消耗最经济2. 实验设计方法 单因子实验确定培养基的成分 多因子实验确定各成分对培养基的影响大小及适宜浓度 多因子:通过较少的实验次数获得所需的结果,正交实验设计、相应面分析等n 为了追求可比性，正交表中的每个水平都要有适当的重复。正交实验所需

4、的实验次数（NL）是有实验需要的水平数（q）决定的：NLnq2。n为自然数。 n 正交表具有3个主要特点：（1）任何两因素之间的都是全面实验，从而保持了可比性。即任何两个因素的各种不同水平的搭配在实验中都出现了，并且出现了相同的次数。（2）任一因素个水平的重复次数相等。（3）绝大多数正交表中各列是等价的，可以任意取用。因此，正交表的实验结果非常易于分析，以至于不需要进行复杂的统计计算，就可直接求出各因素影响的大小、效应的变化趋势等。实验数据实验数T（反应温度）t（反应时间）c（浓度）Y（得率）/%1809053128012065438015073848590653585120749685150

5、54279090757890120562990150664K（和）I123141135 II144165171III183144144k（均值）I414745 II485557III614848R（极值）20812 正交实验:1.根据问题的要求确定因子和水平,列出因子水平表2.根据因子和水平数选用合适的正交表,设计表头,安排实验3.根据正交表给出的实验方案,进行实验4.对实验结果进行分析,选出较优的“实验条件” 以及对结果有显著影响的因子分3组进行: 3因子3水平周二:碳源的影响 乳糖,葡萄糖周三:氮源的影响 醋酸铵周五:前体的影响 苯乙酸 因子水平表水平/因子乳

6、糖/葡萄糖醋酸铵苯乙酸120/107.00.7222.5/7.58.01.0325/59.01.3 L9(34)正交实验结果 试验号 12乳糖/葡萄糖3醋酸铵4苯乙酸抑菌圈 (mm)11111a22123b33132c41222d52231e63213f71333g82312h93321ik1 (a+b+c)/3(a+f+h)/3(a+e+i)/3 k2(d+e+f)/3(b+d+i)/3(c+d+h)/3k3(g+h+i)/3(c+e+g)/3(b+f+g)/3极差 ABC 因素水平效应图:横坐标分为三部分:乳糖/葡萄糖;醋酸铵;苯乙酸纵坐标:抑菌圈的

7、直径在横坐标和纵坐标上找出相应的点,连接成线,从而得出因素水平的效应图三. 实验材料1.菌种:产黄青霉菌(Pencillium chrysogenum); 金黄色葡萄球菌(Staphyloco ccusauoreus)2.培养基发酵培养基:乳糖22.5g,葡萄糖7.5g,醋酸铵8.0g, Na2SO40.5g,MgSO47H2O 0.25g, FeSO47H2O 0.1g,CuSO45H2O 0.005g,MnSO47H2O 0.02g,CaCl22H2O 0.05g,ZnSO47H2O 0.02g,苯乙酸1.0g,蒸馏水1000ml,pH 6.5,121灭菌20min. 注意:微量元素配成母

8、液,按需要加入,苯乙酸用乙醇溶解后再加入生物测定培养基:牛肉膏0.5% 蛋白胨1% 酵母膏0.3% NaCl0.3% 琼脂1.5% 葡萄糖5% pH 6.0 121灭菌20min 需要250ml3. 设备和器皿:摇床,三角瓶,牛津小杯,平皿,离心机,分光光度计,容量瓶等4. 试剂:1% pH6.0磷酸缓冲溶(K2HPO4 2g, KH2PO4 8g,蒸馏水1000ml)；0.85%生理盐水四. 操作步骤1. 发酵培养基的配制:按照正交表配制50ml. (三组:每组配制一种培养基,各接种一瓶,250ml三角瓶装液量为50ml)2. 摇瓶培养:从一级斜面菌株接种到三角瓶液体培养基, 25、200r

9、pm培养6-7天,可进行青霉素的效价测定3.金黄色葡萄球菌菌悬液的制备:将37培养16-18h的斜面菌种,用0.9%的生理盐水洗下离心洗涤3000rpm 5min，将菌悬液稀释至波长650nm透光率为20%的溶液,需要6ml4.生测平板的制备:生测培养基200ml,加入适当稀释的金黄色葡萄球菌后,制成3*3+2个平板5.青霉素发酵液效价的测定: 发酵结束后用1% pH 6.0的磷酸缓冲液将上清发酵液适当稀释.每个被测样品用3套平皿进行测定；37培养18-24h后,量取抑菌圈直径的大小6.填写正交实验表格,确定最适培养基配方五. 实验内容1.不同因子及水平的培养基配制2.产黄青霉菌的液体发酵3.发酵液的效价测定4.最适培养基配方的确定六. 实验结果L9(34)正交实验结果 12乳糖/葡萄糖3醋酸铵4苯乙酸抑菌圈 (mm)111112.15a221231.9