WesternBlotting(半干转)超级详细步骤

1、Western Blotting Analysis Guide （半干转）Western blotting （半干转 ）可分为以下 9 个步骤：一、蛋白的提取A 总蛋白提取1. 将收集的细胞或组织（约0.1 g）从-80°C冰箱取出，按1:10 （w:v）加入冰浴的蛋白裂解液 （RIPA）;并加入1/10体积的蛋白酶抑制剂（PMSF）2. 用 Dounce 手动匀浆器或电动匀浆器，匀浆细胞或组织（ 注意：全程冰上操作，每个 样品用 Dounce 上下抽动相同的次数，电动匀浆器匀浆相同的转速及时间）3. 冰上静置 20 min后，12000 rpm离心，4 °C，15 min

2、，取上清。B 核蛋白提取1. 称取 100 mg 肝脏冰冻组织置于 Dounce 手动匀浆器，加入 1 mL 冰浴的核蛋白裂解 液A，上下抽动5下（注意：全程冰上操作，不同组织上下抽动需摸条件，匀浆后能看到些 许小组织块）2. 将匀浆液倒入 1.5 mL 离心管，瞬时离心 30 s3. 上清倒入另一 1.5 mL 离心管，冰浴 5 min4. 3000 rpm离心，4 °C, 10 min，上清倒入另一 1.5 mL离心管收集（此为胞浆蛋白）5. 沉淀加入50此核蛋白裂解液B吹打，冰浴20 min6. 12000 rpm离心，4 °C, 20 min,将上清吸入 0.5 m

3、L离心管收集（此为核蛋白）。二、蛋白浓度的测定在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将 Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA 分子，工作试剂 由原来的苹果绿形成紫色复 合物，最大光吸收强度与蛋白质 浓度成正比 。1. BCA标准品和样品的准备：（BCA标准品为5mg/mL）配制1mg/mL的标准品：取10让原标准品+ 40丄PBS缓冲液混匀，浓度为1mg/mL 配制0.25 mg/mL的标准品：取5丄上述1mg/mL的标准品+ 15丄PBS缓冲液混匀，浓 度为 0.25 mg/mL样品用水以1 -5倍稀释，并且将蛋白裂解液用PBS缓冲液按相同的比例稀释作为样品的 空白对照（建议样

4、品稀释 2倍，不同组织使用不同稀释倍数） 。2. 配制工作液：根据标准品和样品数量 ，按试剂 A:B=50:1 配制适量 BCA 工作液，充分混匀（注意： BCA工作液室温24 h内稳定）3. 标曲制作与样品测定:按下表比例加入96孔蛋白测定板:0.25 mg/mL的标准品1mg/mL的标准品终浓度031.2562.51252505001000试剂/编号BCA标准品，此02.552.551020PBS，此2017.51517.515100工作液，此200200200200200200200样品测定:2丄样品+ 18丄PBS缓冲液+200丄工作液（可做3个重复）；蛋白裂解液用水按相同 的比例稀释

5、作为样品的空白对照37 °C孵育30 min，酶标仪OD 595 nm测定吸光度；根据标曲和样品吸光度计算出样 品相应的蛋白浓度；将蛋白统一用蛋白裂解液 稀释至合适的浓度（注意：蛋白冰上操作），-80 °C冰箱存放（但存放不久，按蛋白上样比例加入1 xloading buffer,再95°C变性5min, - 80 °C 保存，会比较久）。三、样品的前处理蛋白变性是破环蛋白的三级结构，使抗体识别的抗原表位暴露出来。SDS作用：结合蛋白可以 使蛋白表面带满负电荷，使电泳可以顺利进行。因此，SDS的 质量非常重要，需要新鲜的。DTT作用：强变性剂，减少蛋白二

6、硫键。甘油：助沉剂，使蛋白能维持在胶孔上方。上样体系准备：V样品：V1 fading buffer = 3:1，振荡混匀离心后，95-100 °C水浴5 min，若 是跨膜蛋白70 °C水浴5-10 min，变性前后都需要震荡混匀（4Xloading buffer用PBS液稀释 至1 X，可适当增加1対勺浓度，方便上样，但不可 太大）注意：如果是做蛋白质相互作用，需做变性胶，参照如下：Protein StateGel con diti onLoadi ng bufferMigrati on bufferReduced-DenaturedReducing & Dena

7、turingWith 3-mercaptoethanol or DTT and SDSWith SDSReduced-NativeReducing & Non-DenaturingWith 3-mercaptoethanol or DTT, no SDSNo SDSOxidized-DenaturedNon-Reducing &DenaturingNo 3mercaptoethanol or DTT, with SDSWith SDS3No &mercaptoethanolor DTT, no SDSOxidized-NativeNon-reducing & N

8、ativeNo SDS四、SDS-PAGE电泳1. 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再 用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。2. 配胶配方参照附。该过程戴手套，TEMED等具有神经毒。3. 灌胶A 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶（操作时要使两玻璃对 齐，以免漏胶，小玻板在外，大玻板在内）B 分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP现配现用；TEMED促凝最后添加外），过滤 后作为储存液避光存放于4 °C,可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产 生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可

9、真空抽吸3分钟）， 加入10% AP （0.70.8:100,分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100） 及TEMED （分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000,浓缩胶用0.8: 1000）摇匀即可灌 胶。灌胶时可用10mL枪吸取5mL胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。（灌 胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度；操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样 胶中才不会有气泡）C .灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶上加一层甲醇，液封后的胶凝的更快。当甲醇 和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层甲醇并 用吸

10、水纸将其吸干D .按前面方法配4%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满 浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中（灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生；插梳 子时要使梳子保持水平；由于胶凝固 时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所 以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶）E. 待到浓缩胶凝固后（约1h），将玻板取下，用ddH2O冲洗掉玻板上溢出的胶，并将 冲洗后的浓缩胶放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外；若只跑一块胶，那槽 另一边要垫一块塑料板且有字的一面向外）F. 两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出，并将电泳槽放入大槽中卡稳。并 注入1 Run

11、ning buffer，注满整个电泳槽（若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形 严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出）G . 30min后即可上样。（长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分4子的排列尚未完成 ）4. 上样A 测完蛋白含量后，计算含50 蛋白的溶液体积即为上样量。取出经计算后的合适 体积的样品至PCR离心管中，按体积比V样品：ViRgding buffer = 3:1准备样品，振荡混匀离心 后，95-100 °C水浴5 min,若是跨膜蛋白70 °C水浴5-10 min,变性前后都需要震荡混匀（上 样总体积一般不超过15

12、让，加样孔的最大限度可加20丄 样品；变性可在PCR仪器上，95 °C 变性 5 min）B加足够的电泳液后开始准备上样。用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸 进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板； 加 样太快可使样品 冲出加样孔，若有气泡也 可能使样品 溢出； 加入下一个样品时， 进样器需在 外槽电泳缓冲液中洗涤 3 次， 以免交叉污染）5. 电泳先稳压80V 15-20min,等蛋白marker开始分离，将电压调至120 V，等loading或溴酚 兰刚刚跑出胶，即结束电泳。若只需SDS-PAGE,到此已结束，然后可用考马斯亮蓝或银

13、染 查看蛋白情况（点样时，每块板Marker上再点5此4WDS sample buffer,最边上样品旁的孔 内也5丄4 >SDS sample buffe,消除边缘效应）。五、 PAGE 胶转印转印前准备： 在电泳结束前 30分钟应开始准备工作在电泳过程中 ，提前准备转印所需物品 ：根据转印所用胶的大小，剪一稍比胶大一些 的厚滤纸和一刚好大小的厚滤纸（比如：如果有四块胶，每块所需大小为5cm&cm,则所需 最下面的滤纸大小为5.5cm>8.5cm,最上面的滤纸大小为5cm>8cm）,将此两张膜浸入电转印 液中（80 mL 电泳液和 20 mL 的甲醇混合 液）；再剪

14、四张大小为 5cmR2cm 的 PVDF 膜，左下角 剪去一角，将此膜浸泡在甲醇溶液中不超过1min后取出浸入ddH2O中1min,取出浸入转印 液中（切滤纸和膜 时一定要戴手套，因为手上的蛋白会 污染膜）（如果是 NC 膜，则用镊子捏 住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上， 只有下层才与水接触。这样由于 毛细管作用可使 整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸 水，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中 10min 以排除气泡，随后浸泡入转移液中） 取胶与夹板制作：从转印液中取出 5.5cmR8.5cm 的厚滤纸整齐的平铺于电转槽的正中，将浸泡于转印液 中

15、的四张大小为 5cmR2cm 的 PVDF 膜平铺于厚滤纸上， 注意和滤纸间不要有气泡，再倒一 些transfer buffer到膜上，保持膜的湿润；用翘板（绿色）从胶板（厚板在下，薄板在上）底 部轻轻撬起薄板（撬时一定要小心， 玻板很易裂），用平衡液润湿胶面，根据 Marker 的位置 以及所需蛋白分子量切下大小为5cm>2cm的胶，将胶按照顺序依次平移至滤纸上；再在胶上 铺上事先浸泡于转印液中的5cm$cm的厚滤纸；一手压住滤纸一端，一手用玻璃棒在滤纸上 轻轻滚动以擀走膜、胶以及滤纸之间的空气。（铺胶时，有Marker的一端与剪掉一角的PVDF 膜一致； 膜和胶以及滤纸铺好以后切勿再

16、移动，为防止膜上的电转液 过少或者在擀空气时流 失，可在擀完空气后倒一些电转液 在膜上）转印：A. 三明治夹板制作好后，盖上电转槽盖，一般20V转移40min。B. 转完后如果想检测一下蛋白转印情况，可将膜用1X丽春红染液染5min （于脱色 摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白，将 膜晾干备用。转印条件：1 Xran sferi ng buffer配方参照附。注意： 对于蛋白 分子量 > 100 kD 的蛋白a. 在转印液中加入终浓度为 0.1% SDS；b. 将转印液甲醇终浓度降低为 10%或更低；c. 用半干转印放，40C过夜对于蛋白 分子量 < 100

17、kD 的蛋白a. 在转印液中不加 SDS；b. 将转印液甲醇终浓度保持在 20% 整个过程必须戴手套，防止污染了转印膜及其他物品。六、封闭转印结束，将膜从电转槽中取出，TBST稍加漂洗3次，每次5-10min;尔后浸没于封闭 液中缓慢摇荡 1h。 （必要时可先用丽春红染色（2% 乙酸， 0.5% 丽春红的水溶液）观察蛋白 条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步）封闭是将转印膜上坑坑洼洼的地方用BSA或脱脂奶粉填平，降低抗体的非特异性吸附产 生很浓的 背景。常用5% BSA和脱脂奶封闭，若是做磷酸化蛋白，只能用BSA，因为，奶中含有磷酸化 蛋白。而封闭液

18、浓度，可根据实验需摸索条件。蛋白面朝上，封闭2 h，摇床速度不超过40, 结束后直接进一抗。七、一抗孵育抗体按照说明书浓度用1XTBST稀释，稀释液中可加与封闭同浓度的BSA或脱脂奶，也 可加0.25 - 0.5% BSA或脱脂奶，甚至不加。根据实际情况，背景重杂带多，则多加；背景少 杂带少，可少加。（5ml BSA中加入5此抗体，1: 1000稀释）黏在rotater上, 4°C孵育过夜。第二天，用1 XTBST洗3次，每次5-10 min。八、二抗孵育根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例 稀释(1:10001:10000)，抗体稀释方法同

19、一抗。若背景重，则稀释大 些。黏在rotater上,室温孵育1-2小时，结束后，TBST洗3遍，每次5-10 min。九、抗体偶联 HRP 检测用pierce发光试剂盒，将A液和B液等体积混合后，将膜背面贴在自封袋内侧一边，用 吸水滤纸小心吸去膜上的液体，吸干后将混好的液体加到膜上，立即盖上盖子反应5 min，然 后将膜上的液体用吸 水滤纸吸干，并将自封袋内侧 另一边盖上，置 Versa DocTM imaging system 进行发光检测(自封袋剪去封口处，再将两边剪开)Versa Doc imaging system发光检测使用：打开电源，打开软件Quantity One,然后将膜 放在

20、面板中间，点击软件上的“position”查看整张NC膜是否在视野内，点击“stop”，关闭 仪器门。设置曝光总时间、第一张的曝光时间以及曝光次数。完成后，储存照片，长时间不 用的话关闭 电源。7附录蛋白质分子量范围/103Da适宜的凝胶浓度/%v 1015-2010-501515-6012.515-1001030-1207.530-2005> 2002-515%分离胶配方1块胶2块胶3块胶4块胶5块胶6块胶ddH 2O （ mL）1.1752.353.5254.75.8757.051.5 M Tris-HCI（ mL）1.252.53.7556.257.530% Acr/bis （ m

21、L）2.557.51012.51510% SDS （此）5010015020025030010% AP （止）255075100125150TEMED （止）2.557.51012.515Total volume （mL5101520253012%分离胶配方1块胶2块胶3块胶4块胶5块胶6块胶ddH 20（mL ）1.6753.355.0256.78.37510.051.5 M Tris-HCl（mL ）1.252.53.7556.257.530% Acr/bis （mL ）2468101210% SDS （此）5010015020025030010% AP （止）25507510012515

22、0TEMED （止）2.557.51012.515Total volume （mL51015202530810%分离胶配方1块胶2块胶3块胶4块胶5块胶6块胶ddH 20(mL )2.014.026.038.0410.0512.061.5 M Tris-HCI(mL )1.252.53.7556.257.530% Acr/bis (mL )1.6653.334.9956.668.3259.9910% SDS (此)5010015020025030010% AP (止)255075100125150TEMED (止)2.557.51012.515Total volume (mL )5101520

23、25309%分离胶配方1块胶2块胶3块胶4块胶5块胶6块胶ddH 20(mL )2.054.16.158.210.2512.31.5 M Tris-HCl(mL )1.63.24.86.489.630% Acr/bis (mL )1.2752.553.8255.16.3757.6510% SDS (此)5010015020025030010% AP (止)255075100125150TEMED (止)2.557.51012.515Total volume (mL )510152025307.5%分离胶配方1块胶2块胶3块胶4块胶5块胶6块胶ddH 2O (mL )2.4254.857.275

24、9.712.12514.551.5 M Tris-HCl(mL )1.252.53.7556.257.530% Acr/bis (mL )1.252.53.7556.257.510% SDS (此)5010015020025030010% AP (止)255075100125150TEMED (止)2.557.51012.515Total volume (mL5101520253096%分离胶配方1块胶2块胶3块胶4块胶5块胶6块胶ddH 20(mL )1.32.63.95.26.57.81.5 M Tris-HCI(mL )0.511.522.5330% Acr/bis (mL )0.651

25、.31.952.63.253.910% SDS (此)5010015020025030010% AP (止)255075100125150TEMED (止)2.557.51012.515Total volume (mL )510152025304%浓缩胶配方1块胶2块胶3块胶4块胶5块胶6块胶ddH 20(mL )1.5253.054.5756.17.6259.150.5 M Tris-HCl(mL )0.6251.251.8752.53.1253.7530% Acr/bis (mL )0.3250.650.9751.31.6251.9510% SDS (此)25507510012515010

26、% AP (止)12.52537.55062.575TEMED (止)1.252.53.7556.257.5Total volume (mL )2.557.51012.51510RIPA buffer (Radio Immuno Precipitation Assay buffer)Tris (pH 8.0)NaClNP-40 or Triton X-100 脱氧胆酸钠SDS蛋白酶抑制剂 50mL 每片 。50 mM150 mM1.0% (w/v)0.5% (w/v)0.1% (w/v)蛋白酶抑制剂 PMSF （苯甲基磺酰氟 ，10mmol/L)PMSF17.4mg，异丙醇10mL-20

27、76;C保存。在水液体溶液中不稳定，30分钟就会降解一半，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF,样品处理超过1h补加一次。核 蛋白裂解液 AHEPES（N-2-羟乙基哌嗪-N -2乙磺酸）10 mMNP-400.2% (w/v)NaCl10 mMEDTA1 mM蛋白酶抑制剂（Roche）每50mL加一片（现用现加，使用前 10分钟）。核 蛋白 裂解液 BHEPES20 mM甘油25% (w/v)NaCl420 mMMgCl21.2 mMEDTA1 mMDTT0.5 mM蛋白酶抑制剂 50mL 每片 。4XSDS sample buffer1 M Tris-HCl, pH 6.82.5 mL甘油3.0 mL20% (v/v) SDS stock4.0 mL卩巯基乙醇1.0 mL1% (w/v) 溴 芬兰2 mgTotal volume10.0 mL11抽滤后，-80°C保存，使用时，按 照sample：性 4 min， 加样前，混匀离心5>Runni