超速离心-高效液相色谱测定血清高密度脂蛋白和低密度脂蛋白胆固

1、超速离心超速离心-高效液相色谱测定血清高密度脂蛋白高效液相色谱测定血清高密度脂蛋白 和低密度脂蛋白胆固醇：一种候选参考方法和低密度脂蛋白胆固醇：一种候选参考方法 董军董军 国汉邦国汉邦 陈文祥陈文祥卫生部老年医学研究所卫生部老年医学研究所 HDL-C HDL-C降低降低 和和LDL-CLDL-C升高，是明确的心血管病独立危险因素升高，是明确的心血管病独立危险因素 心血管病防治工作需要准确的心血管病防治工作需要准确的HDL-CHDL-C和和LDL-CLDL-C测定结果测定结果 建立和保证建立和保证HDL-CHDL-C和和LDL-CLDL-C常规测定结果的准确性需要常规测定结果的准确性需要 可靠的

2、参考方法可靠的参考方法HDL-C HDL-C 和和LDL-CLDL-C准确测定准确测定 必要性必要性美国疾病控制与预防中心美国疾病控制与预防中心(CDC) 定量法定量法 D=1.006 超速离心分离极低密度脂蛋白（超速离心分离极低密度脂蛋白（VLDL），），制备底部组分（制备底部组分（BF）( 包括包括IDL, LDL, HDL和和Lp(a)等）等）用肝素用肝素-锰离子试剂沉淀锰离子试剂沉淀BF中的中的 脂蛋白，制备脂蛋白，制备HDL组分组分分别用分别用AK胆固醇参考方法测定胆固醇参考方法测定BF 胆固醇胆固醇(BFC)和和HDLC，自自BFC中减去中减去HDLC得得LDL-C (包括包括ID

3、L和和Lp(a) 样品量大样品量大(5 mL)，其应用受到可得样品量限制，其应用受到可得样品量限制 LDL和和HDL的分离采用化学沉淀法，影响因素较多的分离采用化学沉淀法，影响因素较多 样品制备需多部手工容量操作，费时，技术要求高样品制备需多部手工容量操作，费时，技术要求高 受超速离心转头品种的限制，每次分析最多受超速离心转头品种的限制，每次分析最多18 个样品个样品 由于脂蛋白的不稳定性，样品制备过程（约需由于脂蛋白的不稳定性，样品制备过程（约需24-28小时）小时） 本身造成本身造成HDL-C和和LDL-C的变化的变化 -定量法存在的问题定量法存在的问题血清脂蛋白胆固醇的体外再分布血清脂蛋

4、白胆固醇的体外再分布 超速离心法超速离心法: 各类脂蛋白的定义方法，在分析化学上可能各类脂蛋白的定义方法，在分析化学上可能 也是最可靠的脂蛋白分离方法，是一种物理分离方法，也是最可靠的脂蛋白分离方法，是一种物理分离方法， 影响因素最少。影响因素最少。 电泳法电泳法: 很难用于精密脂蛋白分析。很难用于精密脂蛋白分析。 沉淀法沉淀法: 沉淀剂和沉淀条件多种多样，影响因素多，沉淀剂和沉淀条件多种多样，影响因素多， 较难实现一致的特异性。较难实现一致的特异性。脂蛋白的分离方法脂蛋白的分离方法 超速离心中的定量操作困难、繁琐，样品量大超速离心中的定量操作困难、繁琐，样品量大 部分部分Lp(a)在在HDL

5、密度范围内，造成密度范围内，造成HDL测定偏差测定偏差超速离心法（结合精密胆固醇分析）超速离心法（结合精密胆固醇分析） 参考方法参考方法(2)18385878981180.95 0.96 0.97 0.98 0.99 1.00 1.01 1.02 1.03 1.04 1.05 1.06 1.07 1.08 1.09 1.10 1.11 1.12 1.13 1.14 1.15 1.16 1.17 1.18 1.19 1.20 1.21血清脂蛋白的密度分布血清脂蛋白的密度分布LDLHDLVLDLLp(a) Lp(a)是二硫键连接的是二硫键连接的LDL-apo(a)复和体，还原剂复和体，还原剂 可使

6、可使Lp(a)解离为解离为LDLLp(a-)和和apo(a). Lp(a-)密度与密度与LDL相近，或略小于相近，或略小于LDL. 若能建立条件，使若能建立条件，使Lp(a)解离，又不改变解离，又不改变HDL的密度的密度 性质，则可实现性质，则可实现HDL的超速离心分离的超速离心分离.Lp(a) LDL-apo(a)复合体复合体0.020.040.060.080.0100.0120.0140.0160.0180.00.9801.0001.0201.0401.0601.0801.1001.1201.140DensityChol (mg/dl)EGME不同密度下不同密度下ME对超速离心对超速离心B

7、FC的影响的影响(2)18385878981180.95 0.96 0.97 0.98 0.99 1.00 1.01 1.02 1.03 1.04 1.05 1.06 1.07 1.08 1.09 1.10 1.11 1.12 1.13 1.14 1.15 1.16 1.17 1.18 1.19 1.20 1.21(lp(a),me-)all,me-(lp(a),me)all,meME对血清脂蛋白密度的影响对血清脂蛋白密度的影响1.31.41.51.60.000.020.040.060.080.10ME (mol/L)BFC (mmol/L)样品溶液中样品溶液中ME浓度对浓度对1.063密度下

8、超速离心密度下超速离心BFC的影响的影响 取来自不同个体的血清取来自不同个体的血清49 份份 在在1.063背景密度及背景密度及ME（0.05 mol/L）存在和不存在下）存在和不存在下 超速离心，测定超速离心，测定BFC（BFC1.063ME(+)和和BFC1.063ME(-)） 用免疫比浊法测定用免疫比浊法测定Lp(a)质量质量 用用DCM测定测定HDLC（HDLCDCM）ME 解离解离Lp(a) 有效性有效性0.000.050.100.150.200.250.30010203040506070Lp(a) (mg/dl)BFC1.063-BFC1.063ME (mmol/L)BFC1.06

9、3ME(-)与与BFC1.063ME(+)之差与之差与Lp(a)的关系的关系 (r=0.848)0.000.050.100.150.200.250.300.00.51.01.52.02.5BFC1.063MEBFC1.063-BFC1.063ME (mmol/L)BFC1.063ME(-)与与BFC1.063ME(+)之差与之差与HDLC的关系的关系 ( r=0.093,)bias vs lp(a)-pr(0.15)(0.10)(0.05)0.000.050.100.020.040.060.080.0 BFC1.063ME(+)与与 HDLCDCM之差与之差与Lp(a)的关系的关系 （r =

10、0.414, P0.05） 用ME使使 Lp(a) 解离为游离解离为游离apo(a)和和Lp(a)Lp(a-) 用脯氨酸解离用脯氨酸解离Lp(a)或或apo(a)与脂蛋白的可能非共价键结合与脂蛋白的可能非共价键结合 1.063密度下超速离心，将密度下超速离心，将HDL（BF1.063）与其他脂蛋白分离）与其他脂蛋白分离 1.006密度下超速离心，将密度下超速离心，将HDL和和LDL（BF1.006）与）与VLDL分离分离 用用HPLC测定测定BFC1.006和和BFC1.063 HDLC = BFC1.063 LDLC = BFC1.006 - BFC1.063 (含含IDLC和和Lp(a)C

11、)方法原理方法原理超速离心密度液配制超速离心密度液配制:密度液密度液I: 含含0.1M脯氨酸的溴化钠溶液，使密度为脯氨酸的溴化钠溶液，使密度为1.006密度液密度液II: 含含0.1脯氨酸和脯氨酸和0.05M ME的溴化钠溶液，调节溴的溴化钠溶液，调节溴 化钠浓度，使密度为化钠浓度，使密度为1.0666 (两种密度液（两种密度液（0.8 ml）与血清（）与血清（0.05 ml）混合）混合 后分别给出背景密度后分别给出背景密度1.006 g/ml和和1.063 g/ml)标准溶液和内标溶液配制标准溶液和内标溶液配制:胆固醇乙醇溶液胆固醇乙醇溶液: 浓度浓度 0.646, 1.293, 2.586

12、 , 5.172 , 7.758 mmol/L豆甾醇乙醇溶液豆甾醇乙醇溶液: 浓度浓度5.17 mmol/L，作内标溶液，作内标溶液密度液及标准溶液配制密度液及标准溶液配制样品制备样品制备: 用稀释器的稀释功能加入血清样品用稀释器的稀释功能加入血清样品(体积为体积为0.05ml)和和 稀释剂（密度液稀释剂（密度液, 体积为体积为0.8 ml) 超速离心条件超速离心条件: 20, 23000 rpm, 离心离心18.5 h离心管切割离心管切割: 用离心管切割器在离心管中液体的中间位置切割离心管，取下部用离心管切割器在离心管中液体的中间位置切割离心管，取下部 离心管，内含离心管，内含1.006 g

13、/ml背景密度下的背景密度下的BF（BF1.006）和）和1.063 g/ml 背景密度及背景密度及ME存在下的存在下的BF（BF1.063），进行胆固醇分析），进行胆固醇分析 HDLC = BFC1.063 LDLC = BFC1.006 - BFC1.063超速离心分离脂蛋白组分超速离心分离脂蛋白组分高效液相色谱测定胆固醇高效液相色谱测定胆固醇 I 将内含不同将内含不同BF的下部离心管，置的下部离心管，置10-ml具盖试管中具盖试管中 标准溶液标准溶液0.05 ml，用，用0.5 ml乙醇冲入乙醇冲入10-ml具盖试管中具盖试管中 向各试管中加乙醇向各试管中加乙醇-8.9 mol/L氢氧化

14、钾（氢氧化钾（9:1）4 ml 各管加内标各管加内标0.05 ml，用，用0.5 ml乙醇冲入乙醇冲入10-ml具盖试管中具盖试管中 水平式振荡器振荡水平式振荡器振荡20 min 50 水解水解2h高效液相色谱测定胆固醇高效液相色谱测定胆固醇 II400ul Acetone20l, 4MH2SO4-4MCrO3vortex, RT 5min0.5ml Hexane, 0.5ml waterVortex, 5min200ul supernatant dry down for chromatography0.5ml 水解液水解液0.5mlH2O, 1mlHexaneVortex, 20min0.5

15、ml,Hexane, 挥干挥干高效液相色谱分离胆固醇和高效液相色谱分离胆固醇和6-氯豆甾醇氯豆甾醇0.51.01.52.02.50.51.01.52.02.5DCM HDLC (mmol/L)超速离心法超速离心法HDLC (mmol/L)超速离心法超速离心法HDLC(BFC1.063ME(+)与与 HDLC DCM的关系的关系 (r = 0.998)血清血清 平均值平均值 (mmol/L) 平均批内平均批内CV(%) 总总CV (%) HDLC LDLC HDLC LDLC HDLC LDLC1 1.342 2.897 0.67 0.48 0.96 1.122 2.202 2.778 0.60 0.78 1.01 0.923 1.292 4.148 0.91 0.45 1.73 0.654 0.880 2.874 1.21 0.68 2.07 0.82超速离心超速离心HPLC法测定血清法测定血清HDLC和和LDLC的精密度的精密度用超速离心法分离脂蛋白，所分离的脂蛋白与