病毒中和抗体检测

1、病毒中和抗体检测1.病毒TCID50检测TCID50是指组织培养物（细胞）半数致死剂量。它有几个性质我们必须明白：1）它表示的是计量，不是浓度；2）它是一个单位；3）它的值等于 1,实际上问它的值等于多少是一个没有意义的问题，就像问km的值等于多少一样，如果非要说出的的值等于多少，那我们只能说它的值在任何情况下都等于1。理解这三个性质对于理解TCID50非常重要，但是这三个性质经常被误解，所以导致对TCID50的理解出现偏差。首先我们来看一下这个表示法的意思：病毒滴度为ml o它表示的是每 ml病毒溶液里含有个TCID50的病毒，这和氯化钠的浓度为L表示每L溶液中含有个 mol的氯化钠是一样的

2、道理。经常可以听到人说我的病毒的TCID50是。这个说法是不科学的，应该说我这个溶液里含有个TCID50的病毒或者说我这个溶液的病毒滴度是10KxTCID50/ml。也可以说病毒的 TCID50效价是。TCID50=10Ao即：将病毒悬液作 10A稀释后，接种细胞，可以使 50%勺细胞产生 CPE （将病 毒悬丫作10A稀释后，中含1个TCID50,作其他一些实验时 （如中和试验），一般常用100TCID50/ 或者 100TCID50/ ）本方法的优缺点：.优点：出现阳性结果时间较短 ，且较明显；.缺点：有时候，在用枪头吸 出细胞生长液时，容易出现污染；使用本方法时的注意事项：.稀释病毒时，

3、每做一个病毒稀释度都需要换枪头，减少浓度误差；.96孔板，每孔接种的细胞量：一般在此种测定病毒滴度的方法下，要将细胞密度适当调低 ，至少要比正常传代时低一些 ，否则细胞生长速度过快 ，未到7天则细胞出现死亡，对观察CPE不利. 一般情况下，小塑料瓶（8-9ml液体为正常用量）,培养长慢单层后，消化细胞，加入6ml培养液，吹 匀，吸出其中的2ml,到另外的瓶子，在该瓶中加入14-16ml即可，如果不放心，可以用显微镜看一 下，细胞数过多则补加培养液，少则补加剩余4ml的细胞悬液；维持液，即病毒培养液，配方为：.MEM+2%、牛血清+3将氨酰胺+1%Z抗+NaHCO3;.MEM+3给氨酰胺+1%Z

4、抗+NaHCO3两种维持液的不同在于是否有FBS（小牛血清）.我个人曾经做过实验，在状态很好的细胞上接种病毒，分别使用两种不同的维持液 ，最终结果是一样的，没有什么不同，所以可以根据个人需要进行选择.另外，曾经请教过专门做中和实验的老师，他认为适当的FBS对细胞有保护作用，而且他说这是国外文献上的报道.1） 细胞准备检查培养瓶中的单层细胞，以5ml胰酶一EDTA至微冲洗加入45ml胰酶EDTAZ覆盖单层细胞放平培养瓶，37c 5%CO茹养箱中孵育1020min,直到细胞脱落加入510ml培养液，洗下细胞后移到离心管中以 PBSgfc细胞两次（12000rpm, 5min ）以D-ME丽悬细胞，

5、并用血球计数板计数以D-MEMt将细胞浓度调整到1 X 10A5/ml 乂 10A5/ml在微量培养板的各孔中加入100仙1细胞，相当于X 10A4细胞/孔在37c 5%CO邪养箱中过夜培养（18-22h）,用处于生长相刚达到完全融合 的细胞进行病毒的滴定2）病毒制备3）病毒稀释取冻存的病毒，以病毒生长培养液（VGM稀释10倍，即100微升病毒液+900 微升稀释液，共1毫升。（于EP管中进行，将混合液 充分吹打振荡，很重要！） 做10倍稀释在另一新EP管中加入100 口第一管稀释病毒液（1/10）,按10的比例进行倍 比稀释，再加入900 口稀释液，将混合液充分吹打振荡。以此类推共稀释至10

6、A13 倍。此过程中需要使用加样器和tip头。使用前用75叱醇擦拭加样器，并用紫外线 照射20min,确保无菌。使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜 中打开）4） 病毒接种：取细胞培养板，用多道加中¥器（又称排枪）吸去 96孔板中的培养液，吸取 孵育液或无血清DMEM口在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的 是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。于各孔中加100ul各不同的病毒稀释液，每个稀释度做一列孔，即每个病毒 稀释度做8个平行复孔，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释 度到低稀释度到原液加样。（病毒稀释度的选择10A310A12或者10A4

7、10A13, 因为目的基因不同，重组腺病毒滴度差距很大，应该尽量将稀释度加大，看到有 人用的稀释度是10A610A13）第11列和12列为阴性对照，阴性对照孔中加入100ul含5%台牛血清的DMEM 监测细胞存活情况；切记：设置正常的细胞对照。每次实验要重复 4次，计算标 准差。3456789101112CONCONABCDEFGH37CCO邪养箱中孵育1h,取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔），加入维持液200口继续于37 C, 5% CO邸养5-10大；逐日观察，5-10天后倒置显微镜下观察，计算每一列中出现CPE（cytopathic effects , CPES的孔数

8、。只要有一小点或是一些细胞出现CPE即为阳性，如果无法确定，可与阴性对照比较；如果阴性对照中无任何 CPE且细胞生长良好，最低稀释度 100%日性而最高稀释度100制性，则本试验即为有效；计算每一列中出现阳性的孔数；用 Reed-MuencK计算病毒 TCID50/ml。（1）计算各病毒稀释度阳性孔数目（1）和阴性孔数目（2）（2）计算阳性和阴性孔的累积数。阳性孔累积数由下向上累计（3）;阴性孔累积数由上向下累计（4）（3）计算阳性孔的百分比：比率（5） = （3）/（3）+（4），（6）=（5）X100（4）计算距离比例（PD =（大于50%勺阳性百分比一50） / （大于50%勺阳性百分比

9、一小 于50%勺阳性百分比）TCID50的对数=大于50%勺阳性百分比的最高稀释对数 十距离比例X稀释系数 的对数（稀释系数的对数1:10稀释为1,半对数稀释为，倍比稀释为，1:5稀释为）举例计算：TCID50的测定和计算（Reed-Muencha）病毒液稀 释度细胞管观察结果累计细胞官数细胞管总 数出现CPE的 细胞管所占 的出现CPE管不出现CPE管，出现CPE管不出现CPE(27/27 )10-28019019100(19/19)10-37111112(11/12)10-435461040(4/10)10-517；E_11314(1/14)10-60802

10、1210(0/21)出现细胞病变（CPE以及血凝素等的细胞管数分别列于表 14-2的第二和第三列 它们的累计数分别列于第四和第五列（根据箭头所示方向），第六列为细胞管总数，第七列为出现细胞病变的细胞管数占细胞管总数的百分率。可见该病毒株的 TCI4在10-3 （%）和10-4 （40%）之间，其确切稀释倍数可按下列公式计算：（高于50%的百分数）-50（高于50%的百分数）-40 （低于50%的百分数）将由上式获得加在高于50%E亡的稀释度的对数（3）上，因此该病毒的TCIQ。应 是 稀释的病毒液。查反对数得 6310，即该病毒6310倍稀释液等于1个TCIQ。2.中和实验1）细胞准备检查培养

11、瓶中的单层细胞，以5ml胰酶一EDTA至微冲洗加入45ml胰酶EDTAZ覆盖单层细胞放平培养瓶，37C 5%CO2W养箱中孵育1020min,直到细胞脱落加入510ml培养液，洗下细胞后移到离心管中以 PBSgfc细胞两次（12000rpm, 5min ）以D-ME丽悬细胞，并用血球计数板计数以D-MEM将细胞浓度调整到1 X 10A5/ml 乂 10A5/ml在微量培养板的各孔中加入100仙1细胞，相当于乂 10A4细胞/孔在37c 5%CO邪养箱中过夜培养（18-22h）,用处于生长相刚达到完全融合 的细胞进行病毒的滴定2）待测血清准备动物血清中，含有多种蛋白质成分对抗体中和病毒有辅助作用

12、，如补体、免疫 球蛋白和抗补体抗体等。为排除这些不耐热的非特异性反应因素，用于中和试验的血清须经加热灭活处理。各种不同来源的血清，须采用不同温度处理，猪、牛、 猴、猫及小鼠血清为60 C；水牛、狗及地鼠血清为62C；马兔血清为65 C；人 和豚鼠血清为56 Co加热时间为20-30min, 60c以上加热时，为防止蛋白质凝 周，应先以生理盐水作适当稀释。取已灭活处理的血清，在96孔微量细胞培养板上，用稀释液作一系列倍比稀 释，使其稀释度分别为原血清的1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64,或者按1:10 , 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:64

13、0, 1:1280 稀释，每个稀释度做 3-4 个 平行孔。3）加入病毒，感作以 VGM等病毒稀释到 100 TCID50/50 a l （200 TCID50/100 a ）除细胞对照孔外每孔中加入与血清量相等的病毒液，在细胞对照孔中加入与血清量相等的VGM轻混病毒血清混和物，37 C 5%CO2W养箱中孵育2h 4）接种细胞准备用于接种的刚达到完全融合的细胞的培养板，吸掉培养液，加入3501无血清D-MEMS养液以洗掉剩下的FBS病毒-血清混和物孵育2h结束后，各取100屋 中和液到细胞培养板相应的孔 中37 C 5%CO2W养箱中孵育2h吸掉中和液，力口 250仙l D -MEM洗涤加2

14、00仙l DMEM在37C5%CO邪养箱中孵育3 4d,检测培养液中血凝活性， 以能保护50%细胞培养管不被感染的最高血清稀释度的倒数作为中和终点。在制备细胞悬液时，其浓度以在 24h内长满单层为度：血清病毒中和 1h后 取出，每孔加入100屋 细胞悬液。置5%COZ7c温箱培养,自培养48h开始逐 日观察记录，14D终判。由于各种病毒引起细胞病变时间不同，终判时间应根据 病毒致细胞病变的快慢而定。5）对照组对照的设定：包括细胞对照（培养液中仅含细胞，不含病毒和血清），阴性对照（培养液中含有l00TCID50病毒、细胞及阴性血清）和空白对照（培养基中 含有100TCID50病毒及细胞，不含血清

15、）,各设3个平行孔。为保证试验结果的准确性，每次试验都必须设置下列对照，特别是在初次进 行该种病毒的中和试验时，尤为重要。阳性和阴性血清对照：阳性和阴性血清与待检血清进行平行试验， 阳性血清 对照应不出现细胞病变，而阴性血清对照应出现细胞病变。病毒回归试验：每次试验每一块板上都设立病毒对照相馆， 先将病毒作、1、 10、100、1000 TCID50稀释，每个稀释度作4孔，每孔加50仙l。然后每孔100屋 细胞悬液。TCID50应不引起细胞病变，而且100TCID TCID50必须引起细胞病 变，否则该试验不能成立。血清毒性对照相：为检查被检血清本身对细胞有无任何毒性作用， 设立被检 血清毒性

16、对照是必要的。即在组织细胞中加入低倍稀释的待检血清 （相当于中和 试验中被检血清的最低稀释度）。正常细胞对照相：即不接种病毒和待检血清的细胞悬液孔。正常细胞对照应 在整个中和试验中一直保持良好的形态和生活特征， 为避免培养板本身引起试验 误差，应在每块板上都设立这一对照。6）结果判定和计算当病毒回归试验，阳性、阴性、正常细胞对照相，血清毒性对照全部成立时， 才能进行判定，被检血清孔出现 100%CPEJ为阴性，50%Z上细胞出现保护者为 阳性；固定病毒稀释血清中和试验的结果计算，是计算出能保护50%ffl胞孔不产生细胞病变的血清稀释度，该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。举例计算：用Reed和Muench两氏法（或Karber法）计算结果，固定病毒 稀释血清法中和抗体效价计算如表2-26血清稀释CPE数无积累CPE积累无CPE CPE比率 百分数1:40/4040120/1201:80/404080/801:161/413141/5201:323/431414/5801:644/440808/810080%-50%距离比例二二80% 20%Ig TCID50=高于50%血清稀释度的对数距离比例X稀释系数的对数Ig TCID50 =乂 （-）=（稀释系数的对数1:10稀释为1,半对数稀释为，倍比稀释为