交大生化笔记

1、第十二章 DNA 的复制、修复与重组 DNA 技术DNA是储存遗传信息的物质，亲代的遗传信息如何真实地传给子代，这个问题的实质就是DNA分子如何复制(replication)成完全相同的两个拷贝，即DNA的合成，可见通过复制，遗传信息得以在传代中保留。DNA分子中的遗传信息又如何表达呢？现知基因表达的第一步是通过转录(transcription)，即DNA的碱基按互补配对(G-C, A-T，A-U)的原则转变为 RNA分子上相应的碱基序列，接着 RNA通过翻译(translation )，以三个碱基的序列作为一个氨基酸的遗 传密码， 从而决定蛋白质的一级结构。 不同基因编码不同结构的蛋白质，

2、表现出不同的功能， 因而体现出多种多样的生命现象。遗传信息从DNA经RNA流向蛋白质的过程，是Crick于1958年提出的,称为分子生物学的中心法则 (central dogma)( 图 12-1) 。 1970 年 Temin 提出“逆 向转录” (reverse transcription) 扩充了中心法则的范围。基因或DNA是遗传信息的携带者，在细胞分裂过程中，亲代细胞所含的遗传信息，完整 地传递到两个子代细胞。这个过程的实质问题是DNA分子如何复制成完全相同的两个拷贝，有许多酶和蛋白质参与复制过程，通过正确和完整的复制，亲代DNA的遗传信息真实地传给子代,这是遗传信息一代一代传递下去的

3、分子基础,这也是本章的重点内容。但生物体内外 环境存在着使 DNA分子损伤的因素，因此机体还必须有一套DNA修复的机制。最后还将介绍一些有关重组DNA技术的概念和方法。第一节 DNA 复制的几个基本原则一、半保留复制Watson 和 Crick 于 1953 年提出的 DNA 双螺旋模型,碱基互补配对的原则,为 DNA 分 子的复制提供了理论基础,即亲代的 DNA 双链,每股链都可以作为模板,按碱基互补配对 原则指导 DNA 新链的合成, 这样合成的两个子代 DNA 分子,碱基序列与亲代分子完全一样。 但一条链是来自亲代的 DNA 链, 另一条链是新合成的链, 此即为半保留复制1514(sem

4、iconservative replication) 。用 15N 标记亲代的 DNA 链,而用 14N 标记新合成的 DNA 链的 实验，证实子代的 DNA分子，一股链含15N，另一股含14N。、半不连续复制DNA双螺旋的两股链是反向平行 (antiparallel)的，新合成的两股子链，一股的方向为5' t3',另一股为3 't 5'。那么体内是否存在两种 DNA聚合酶？一种催化核苷酸以 5'宀3' 方向聚合，另一种以3 ' t 5 '方向聚合。但从现知所有的 DNA聚合酶都只能催化 5't 3' 方向合成。这

5、个问题直到1968年冈崎(Okazaki)发现大肠杆菌 DNA复 制过程中出现一些含1000 2000 个核苷酸的片段，一旦合成终止，这些片段即连成一条长链。这种小片段被称为 冈崎片段(Okazaki fragment)。因此，复制时亲代 DNA分子中那股3 t 5'方向的母链作为 模板，指导新链以5' t 3'方向连续合成，此链称为前导链(1eading strand)。在前导链延长1000 2000 个核苷酸后， 另一母链也作为模板指导新链也是沿 5 t3 合成 1 000 2 000 个 核苷酸的小片段，这就是冈崎片段。随着链的延长，可以有许多个冈崎片段，这条称

6、为随从链(1agging strand)。可见，随从链为不连续复制，所以DNA为半不连续复制(semi-discontinuous replication) ，如图 12-2 所示。复制后，这些冈崎片段由 DNA 连接酶的作 用而连接成完整的新链。三、 RNA 引物目前所发现的 DNA 聚合酶都需要一个具 3 -OH 的引物，才能将合成原料 dNTP 一个一 个接上去。因为DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP在DNA模板上进行聚合，如图12-3所示。实验又发现抑制 RNA 聚合酶的药物如利福霉素 (rifampicin) 能抑制 DNA 的复制。再者 在体外DNA复制实验中发现冈崎片段的5&

7、#39;端都有一小段412个核苷酸的RNA引物(RNAprimer)。现知RNA聚合酶合成新链时不需要引物，能直接催化游离NTP聚合。可见 RNA引物为DNA聚合酶提供聚合新核苷酸所需的3 ' -OH oRNA引物最后被DNA聚合酶I除去，留下的空隙也由该酶补满，缺口再由 DNA 连接酶封口。在 DNA 的复制需要 RNA 引物呢，除了 DNA 聚合酶不能催化两个游离 dNTP 的聚合， 而 RNA 引物酶却具有此能力外， 这种作用尚可尽量减少 DNA 复制起始处的突变。 因为游离 核苷酸起始处的聚合最容易出现差错，若用 RNA 引物，即使出现差错，由于最后将被 DNA 聚合酶I切除，

8、便可提高DNA复制的真实性。四、复制的真实性DNA 复制的DNA 复制过程是非常复杂的，需要许多酶类和蛋白质因子参加。这既保证 速度，又保证产物的高度真实性。 这也保证了自然界种族延续中生物遗传特性的相对稳定性。第二节 参与 DNA 复制的一些酶类和蛋白质一、大肠杆菌的 DNA 聚合酶DNA 聚合酶（ DNA polymerase ）的作用是将脱氧核苷酸连接成DNA ，所用底物必须是四种脱氧核苷三磷酸 （dNTP ） ，Mg 2+存在和一个 DNA 模板，按模板的序列将配对的脱氧核 苷酸逐个接上去， 并且需要一个具有 3' -0H的RNA弓|物或DNA的3 ' -0H端。使3&

9、#39; -OH 与合成上去的dNTP分子a -磷酸连接成3' , 5'磷酸二酯键，合成方向为5'宀3'，如图12-4。从大肠杆菌纯化得到 3种DNA聚合酶（I,n,川）。（一）DNA聚合酶I1955年Kornberg发现了 DNA聚合酶I （简称为pol I ），故也称为 Kornberg酶，并因此 而获得诺贝尔奖金。DNA聚合酶I是一条分子质量为103X103 Da的多肽链。具有多种催化功能。若用蛋白酶轻度水解可得一个分子质量68X103 Da的大片段和一个分子质量为36X103Da 的小片段，常将大片段称为 Klenow 片段，此片段具有两种催化活性，一为

10、上述的聚合功 能，另一为3'宀5'外切酶的活性，从 3'端水解DNA产生3'单核苷酸，如图12-5所示。这种3'宀5'外切酶活性对保证 DNA复制的真实性具有重要的意义。DNA聚合酶在接上新的核苷酸前，它能对3'末端的碱基进行识别。若为配错的碱基，即通过3't 5'外切酶活性把配错的碱基切除，再使正确的碱基聚合上去，保证DNA 复制的高度真实性，这种功能也称校读功能（proof reading）。小片段则具53'外切酶的活性，它能从5'宀3'方向一个挨一个切除，产物为5'单核苷酸，或跨过若干

11、个核苷酸再进行酶解，从5 '末端释放一寡核苷酸。可除去冈崎片段5 '端的RNA引物和在DNA损伤修复中起重要的作用。可见，DNA聚合酶I为一条多肽链上具有三种酶的活性，也是一种多功能酶（图12-7）。但DNA聚合酶I并不是大肠杆菌DNA复制中主要的DNA合成酶，它的主要作用，是切除RNA 弓物、填补空缺和 DNA 损伤的修复。DNA聚合酶I为一条多肽链上具有三种酶的活性，是一种多功能酶（图12-7）。鉴于Klenow片段兼具聚合及3'5'外切活性，能非常准确按模板碱基序列合成DNA ,3 / 19所以此片段是分子生物学常用的工具酶。(二)DNA聚合酶n由一条多肽

12、链构成。此酶除具有聚合酶的活性外，还具有3't 5'外切酶活性。它在生物体内的确切作用不详，可能也是在 DNA 损伤修复中起作用。(三)DNA聚合酶川此酶是一个多聚酶，由10种不同亚基组成的(图12-8)，称为DNA聚合酶川全酶(DNApolymerase川holoenzyme)。它具有三个特点：是一种非常高的续进性(processivity)酶。所谓续进性即在 DNA聚合酶与模板分离下来之前加入的核苷酸平均数。续进性仝500 000。而DNA聚合酶I仅合成3200个核苷酸即自模板上释放。 DNA聚合酶川催化活性比 DNA 聚合酶I高很多倍，每秒可催化1 000个核苷酸的聚合，

13、 而DNA聚合酶I每秒仅催化 1620个核苷酸聚合。DNA聚合酶川不但催化活性大、合成速度快，而且由于具有3'宀5'外切酶活性，产物真实性高。所以，大肠杆菌DNA聚合酶川是DNA复制必需的酶。DNA聚合酶川聚合和校正功能分别存在于a和&亚基。3DNA聚合酶川全酶分子质量约 900X10 Da,全酶成不对称的二聚体， 围绕着DNA双螺 旋，每个单体都具有催化活性，一个作用于前导链，另一个作用于随从链，使DNA 两股链在同一位置同一时间进行合成。二、真核细胞的 DNA 聚合酶真核细胞的 DNA聚合酶有5种，即DNA聚合酶a、B、丫、3和&。DNA聚合酶a 负责随从链

14、的合成，DNA聚合酶3和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen , PCNA) 负责前导链的合成。 PCNA 是作为 DNA 聚合酶 3 活性所需的一种辅助蛋白， 有与 E.coli DNA 聚合酶川的B亚基类似的结构和功能，形成环状的夹钳，大大地增强DNA聚合酶3的续进性。DNA聚合酶丫负责线粒体 DNA(mitochondria DNA, mt DNA) 的复制，DNA聚合酶B和 & 的功能为 DNA 的修复。三、解旋、解链酶类复制时 DNA 双螺旋要解开，才能在原来的母链上合成新链。复制在不断延伸，螺旋要 不断解开。若每秒钟复制 1

15、000个碱基对，则要解旋 100次。这样必然在复制前方产生很大 的张力，使 DNA 缠结，这要靠 DNA 拓扑异构酶等来解决。(一) DNA 解链酶DNA 复制时，复制开始部位的 DNA 双螺旋必须解开成单链，模板链上的碱基才能以碱 基配对原则，指导新链的合成。解开 DNA 双螺旋的酶有多种，称为 DNA 解链酶 (DNA helicase),该酶具有 ATP酶的活性，在 ATP的存在下，该酶能解开 DNA双链，每解开1对 碱基消耗 2 个 ATP。(二 ) 单链 DNA 结合蛋白单链 DNA 结 合蛋白(single strand binding protein , SSB)或螺旋去稳定蛋白

16、(helix destabilizing protein HDP) ，能与已被解链酶解开的单链 DNA 结合，以维持模板处于单链状 态，又可保护其不被核酸酶水解。单链 DNA 结合 SSB 后既可避免重新形成双链的倾向，又 可避免自身发夹螺旋的形成，还能使前端双螺旋的稳定性降低，易被解开。当DNA 聚合酶在模板上前进，逐个接上脱氧核苷酸时， SSB 即不断脱离，又不断与新解开的链结合。(三) DNA 拓扑异构酶 拓扑一词是指物体作弹性移位而又保持物体不变的性质。 DNA 拓扑异构酶 (topoiso- merase)有两类：其中拓扑异构酶I,曾有过多种其他名称如转轴酶、解缠酶等。它能切断 DN

17、A 双链中的一股，使 DNA 解链旋转时不致缠结，解除张力后又把切口封闭。拓扑异构酶 H,又称旋转酶(gyrase),暂时切断 DNA双链，使另一 DNA双链经过此切口，随后又再封 闭切口。四、引发体弓I发体(primosome)是由多种蛋白质及酶组成，是DNA复制开始所必需的。引发体中的某些蛋白质如 DnaA 能结合至 DNA 复制起始部位, DnaB 具有解链酶的作用, DnaC 辅助 DnaB 结合到复制起始点，使起始部位的双链解开。而引发体中的引物酶(primase)在已解开起始部位的 DNA 单链按碱基互补配对催化 NTP 聚合,合成一小片段的 RNA ,作为 DNA 合成的引 物，

18、即沿此引物 RNA的3' -OH进行延伸。五、 DNA 连接酶DNA连接酶(DNA 1igase)催化两段DNA链之间磷酸二酯键的形成。要求DNA链3'端有游离的 0H，而5'端带有磷酸根，连接过程需要ATP供能,如图12-9。DNA 连接酶不能连接两分子单链的 DNA ，只能作用双链 DNA 分子中一股链上的缺口，或双链 DNA 分子双股的缺口。 如 DNA 经限制性内切核酸酶切割后， 两个片段的粘性末端相配，DNA连接酶能使之连接。即使是两段平齐DNA , DNA连接酶也能使之连接。在DNA复制过程中，当RNA引物清除后，靠DNA聚合酶I填补空缺，冈崎片段之间的缺口

19、靠 DNA 连接酶作用而连成完整的一条新链。 DNA 连接酶在 DNA 损伤修复中亦起重要作用，并且是 一种重要的工具酶。第三节 DNA 复制过程一、复制的起始大肠杆菌复制时有特定的起始部位称为oriC，长度为245bp。有3个串连排列的核苷酸序列，每个由 13 个核苷酸组成。其序列基本相同为 GATCTNTTNTTTT ，而且 GATC 在 oriC 部位出现 11 次， oriC 还有 4 个 DnaA 结合位点，是 4 个 9bp 序列的反向重复，这些序列都 是高度保守的(图 12-10。)DnaA先结合至复制起始点，然后发动了复杂的变化。DnaB和DnaC亦参加进去，从而使双链解开，

20、DNA 结合蛋白便与单链 DNA 结合。接着引物酶按碱基配对原则合成一小段的 RNA引物，此引物的3' -OH可供DNA聚合酶川将第一个 dNTP加到3' -0H上而形成3 5'磷酸二酯键。复制是从oriC开始，同时向两个方向进行的，称为双向复制(bi-directionalreplication) 。复制开始后由于 DNA 双链解开，在两股单链上进行复制。在电子显微镜下观察DNA复制前进部位伸展成叉状，称为复制叉 (replication fork) ，如图 12-12。二、复制的延长在DNA聚合酶川的作用下，新合成的DNA链不断延长。大肠杆菌的冈崎片段长度为1000

21、2 000个核苷酸，即前导链合成 1 0002 000 个核苷酸后，随从链便开始合成。在延长过 程中，由于拓扑异构酶的作用，避免了在复制叉前方的 DNA 打结。三、复制的终止在DNA延长阶段结束后，原核生物的 RNA引物被DNA聚合酶I切除。留下的空隙， 由DNA聚合酶I进行补满，即从另一冈崎片段的 3' -OH按5'宀3'根据碱基配对原则， 将一个个的 dNTP 补上去。最后的缺口再由 DNA 连接酶将相邻的两个核苷酸借磷酸二酯键 连起来，即成完整的一条新链， DNA 的复制即告完成，如图 12-15。6 / 19四、真核生物端粒 DNA 的复制真核生物线性染色体的两

22、个末端称为端粒（telomere）。按上述DNA复制机制新合成子链5'端的那段RNA引物被切除后，必留下一个空缺，假如每次细胞分裂或DNA复制都是如此，端粒将会不断缩短，最终导致关键基因的丧失及种系灭绝的危险，但事实并非如此。那 么真核生物一定存在着某种阻止端粒缩短的机制。（一 ） 端粒 DNA 的结构和端粒酶对端粒 DNA 序列的分析，发现端粒 DNA 的 3'端是由数百个串联重复 GT 丰富的短的 寡核苷酸序列，如四膜虫的重复序列为-GGGGTT-，人为-AGGGTT-。端粒DNA序列虽不含功能基因，但对维持染色体的稳定性起着重要作用。如果端粒丧失，染色体之间可能出现端 -

23、端融合、降解、重排乃至染色体丢失等变化，最后细胞衰亡。近年来，发现了一种能防止端粒缩短的酶，称为端粒酶（telomerase）,该酶由蛋白质和 RNA 两部分组成，其中 RNA 作为合成端粒 DNA 的模板，端粒酶是目前所知唯一携带 RNA 模板 的逆转录酶,具有种属特异性,例如四膜虫的端粒酶,其 RNA 部分含 159 个核苷酸,其中 有一段序列为 5' -CAACCCCAA-3 '可作为合成端粒 DNA3 '端 GT 丰富序列 -GGGGTT- 模 板。人端粒酶的 RNA 含 450 个碱基,其中 -CUAACCCUAAC- 为合成 -AGGGTT- 的模板。这 样

24、可防止细胞分裂时 DNA 复制端粒的缩短。端粒、端粒酶和细胞的衰老有密切关系。有人将端粒称为分子钟或有丝分裂钟。但是恶 性肿瘤细胞当端粒缩短到某种程度,端粒酶活性又重新出现,对端粒进行补偿,使之永不衰 亡,形成恶性增殖。（二）端粒酶的作用机制第四节 DNA 的损伤与修复DNA 是储存遗传信息的物质。 从生物遗传角度来讲, 要求在复制过程中保持遗传密码的 稳定性, 物种才能得以延续。 哺乳动物单倍体细胞的基因组由2.9X109 bp DNA 组成。 动物一生中, 从受精卵细胞到个体死亡, 这些遗传密码要经过千万次的复制。 在物种进化的长河中, DNA 复制的次数更是难以计数,而且生物体内外环境都

25、存在着使DNA 损伤（ DNA damage）的因素。可见,除 DNA 复制的高度真实性外,还要求某种修复 DNA 损伤的机制。每一遗传 信息都以不同拷贝储存在 DNA 两条互补链上。因此,若一条链有损伤,可被修复酶切除,并以未损伤的信息重新合成与原来相同的序列，这就是 DNA 修复( DNA repair )的基础。 但是在漫长的进化过程中， DNA 的序列还是会发生改变 , 通过复制传递给子代成为永久 的，这种 DNA 的核苷酸序列永久的改变称为突变 (mutation) 。若发生的突变有利于生物的生 存则保留下来，这就是进化；若不适应于自然选择(nature selection) 则被淘

26、汰，因此生物的进化可以看成是一种主动的基因改变过程，这是物种多样性的原动力。所以，生物的变异是绝 对的，修复是相对的。一、造成 DNA 损伤的因素造成 DNA 损伤的因素有生物体内自发的、亦有外界物理和化学等因素。(一 ) 自发的因素由于 DNA 分子受到周围环境溶剂分子的随机热碰撞 (thermal collision) ，腺嘌呤或鸟嘌呤与脱氧核糖间的N-糖苷键可以断裂，使A或G脱落。人体细胞中DNA每天每个细胞要脱落5 000 个嘌呤碱，每天每个细胞也有 100 个胞嘧啶自发脱氨而成尿嘧啶。(二 ) 物理因素1紫外线损伤由于嘌呤环与嘧啶环都含有共轭双键，能吸收紫外线而引起损伤。嘧啶碱引起的

27、损伤比嘌呤碱大10倍。损伤是由于嘧啶二聚体的产生，即2 个相邻嘧啶碱的 C5和C6共价交联，如图12-18所示。2 电离辐射损伤如X射线和丫射线，可以是辐射能量直接对DNA的影响，或DNA周围的溶剂分子吸收了辐射能，再对 DNA 产生损伤作用。如碱基的破坏、单链的断裂、双 链的断裂、分子间的交联、碱基脱落或核糖的破坏等。(三 ) 化学因素二、DNA 损伤的类型根据 DNA 分子的改变，可把突变分为下面几种主要类型。(一)点突变点突变(point mutation)是DNA 分子上一个碱基的变异，可分为：转换(transition)同型碱基，如一种嘌呤代替另一种嘌呤或一种嘧啶代替另一嘧啶。颠换(

28、transversation)异型碱基，即嘌呤变嘧啶，或嘧啶变嘌呤。点突变可根据发生在DNA 分子的部位，如发生在启动子或剪接信号部位可以影响整个基因的功能；若发生在编码序列，有的可以改变蛋白质的功能如引起镰状红细胞贫血；有的则为中性变化，即编码氨基酸虽变化，但功能不受影响；有的甚 至是静止突变，碱基虽变但编码氨基酸种类不变。(二 ) 缺 失缺失 (deletion) 是一个碱基或一段核苷酸链乃至整个基因，从 DNA 大分子上丢失。如有 些地中海贫血、生长激素基因缺失，再如上述Lesch- Nyhan 综合征是 HGPRT 基因缺失。(三) 插入插入 (insertion) 是一个原来没有的碱

29、基或一段原来没有的核苷酸序列插入到 DNA 大分子 中去，或有些芳香族分子如吖啶(acridine) 嵌入 DNA 双螺旋碱基对中，可以引起移码突变(frame-shift-mutation) ，影响三联体密码的阅读方式。(四) 倒位DNA 链内部重组，使其一段方向颠倒。三、修复机制(一 ) 光修复机制这种机制主要存在于低等生物。1. 不需要光复活酶光复活酶 (photoreactivating enzyme) 也称为 DNA 光修复酶 (photolyase) 。当 280nm 紫外线 照射 DNA 产生的嘧啶二聚体，在短波 239nm 照射下，二聚体即分解成单体。2. 需要光复活酶 紫外线

30、照射使光复活酶激活，能解聚嘧啶二聚体。(二 ) 切除修复因不需要光照射，故也称暗修复。DNA引起大的损伤，包括UV引起的嘧啶二聚体、嘧啶/ 环丁烷二聚体、几个其它类型的碱基加合物、通过曝露于香烟的烟尘在DNA 中形成的苯并芘尿嘧啶。一般由切除修复(excision repair)系统修复。该修复途径对所有生物的生存是关键的。在大肠杆菌 E.coli 中，有一种 UV 特异的切割酶 (excinuclease 或 UVrABC enzyme) ， 能识别UV照过产生的二聚体部位。并在远离损伤部位5'端8个核苷酸处及3 '端4个核苷酸处各作一切口。像外科手术“扩创”一样，将含损伤的

31、一段DNA切掉。DNA聚合酶I进入此缝隙， 从 3' -OH 开始，按碱基配对原则以另一条完好链为模板进行修复。 最后由 DNA 连接酶将新合成的 DNA 片段与原来 DNA 链连接而封口 (图 12-19) 。真核细胞的切割核酸酶的作用和机制，是与细菌的酶完全类似的方式对嘧啶二聚体切割。切除修复是人体细胞的重要修复形式，有些遗传性疾病如着色性干皮病(xeroderma pigmentosum) ，是常染色体隐性遗传性疾病。纯合子患者的皮肤对阳光或紫外线极度敏感，皮肤变干、真皮萎缩、角化、 眼睑结疤、角膜溃疡，易患皮肤癌。此病是由于缺乏 UV 特异内切核酸酶造成的。(三 ) 碱基切除修

32、复每个细胞都有一类 DNA 糖苷酶 (DNA glycosylase) ，每一种酶能识别一种 DNA 分子中改 变的碱基，能水解该改变的碱基与脱氧核糖间的糖苷键，使改变的碱基脱落，在 DNA 上产 生一个缺嘌呤或缺嘧啶的位( apurinic-or apyrimidinic-site ， AP site) ,再藉切除修复机制进行 修复。现知至少有 20 种不同的 DNA 糖苷酶，各具特异性。 如识别胞嘧啶脱氨生成的尿嘧啶， 腺嘌呤脱氨基产物，开环的碱基，不同烷基化类型的碱基等。如胞嘧啶脱氨后即成尿嘧啶， 若不纠正，可引起类型转换，即G-C t A-T。碱基切除修复( base-excision

33、 repair )步骤如下：1) DNA 糖苷酶识别损伤的碱基 , 在碱基和脱氧核糖之间切割。2) AP 核酸内切酶切 AP 位置附近的磷酸二酯键。3) DNA聚合酶I用它的53 '外切酶活性除去损伤链，从缺口的3' - OH起始 修复合成 , 用新合成的 DNA 替代。4) 最后缺口由 DNA 连接酶封口 (图 12-20)。尿嘧啶DNA糖苷酶修复的发现，解答了一个长年以来的疑题，即组成 RNA是U，而组 成DNA却是甲基化为T,即从UMPtdTMP，要消耗能量。但 U和T都与A互补配对，所 编的密码是相同的。生物体为什么花如此代价 ? 现在问题清楚了，尿嘧啶 -DNA 糖苷

34、酶只能 切除DNA链上的尿嘧啶，而不能切除 DNA链上的胸腺嘧啶，因为后者 C5有一甲基，好像 是给尿嘧啶加上一个标签。胞嘧啶脱氨基后形成的尿嘧啶即无此标签，即被该糖苷酶识别为 改变了的碱基。若 DNA 与 RNA 一样也用尿嘧啶， 那么胞嘧啶脱氨形成尿嘧啶， 与正常部位 的尿嘧啶便无法区别， 不能纠正，造成子代DNA的突变即GCt AT。可见DNA由T代替U , 能增加遗传信息的稳定性。相反， RNA 不需修复，拷贝数很多，半衰期短，即使有个拷贝的 胞嘧啶脱氨基转变为 U，影响也不大，合成出来的绝大多数蛋白质还是具有正常生理功能，而且 U 作为合成原料经济得多。第五节 重组 DNA 技术DN

35、A 重组 (recombination of DNA) 是自然界常见现象，指的是在两个 DNA 分子之间，或 一个 DNA 分子的两个不同部位之间通过链断裂和片段的交换重接， 改变了基因的组合序列。 这种交换可发生于同一细胞内或细胞间，甚至不同物种的 DNA 。 DNA 重组现象广泛存在于 真核细胞、原核细胞乃至病毒和质粒。本节所要介绍的重组 DNA 技术或基因工程 (genetic engineering) ，是 70 年代由 Stanford 大学 Boyer 、Cohen 和 Berg 等科学家建立的一种革命性的技术方法，它是在实验室内用人工 方法将不同来源， 包括不同种属生物的 DNA

36、 片段， 拼接成一个重组 DNA(recombinant DNA) 分子，将其引入活细胞内，使其大量复制或表达。这种技术方法称为重组 DNA 技术。由于 它可以把一个生物体中携带的某一特定的遗传信息(基因 )，通过一定的方法转移到另一生物体中，使之获得前者的遗传特征，创造新的遗传组合，所以又称为基因工程，若从遗传角度 来考虑也可称为遗传工程。 重组 DNA 技术中所含有的目的 DNA 分子或基因需进行无性繁殖、 扩增成为一个克隆 (clone) ，因此基因工程在不同的场合又可有不同的名称，如分子克隆 (molecular cloning) 、 DNA 克隆、基因克隆等。一、基因工程的基本步骤

37、基因工程可分为三个过程。(一 ) 重组 DNA 分子的构建即将一目的 DNA 序列或基因共价连接于一个 DNA 载体上构成一个重组 DNA 分子。(二 ) 引入宿主细胞用转化、感染或转染等方法使重组 DNA 分子进入宿主细胞，如细菌、酵母、动物细胞。(三 ) 筛选挑选含有重组 DNA 分子的细胞，使之克隆化并加以鉴定，可大量扩增或表达。二、重组 DNA 分子的构建重组 DNA 分子的构建需要下面几个方面的条件与方法。(一 ) 目的基因或 DNA 片段所要研究的某一基因或某段 DNA 序列有下列来源：1基因组 DNA(genomic DNA)2cDNA 可以是先分离某一特殊 mRNA ，这些 m

38、RNA 在逆转录酶催化下合成单股互 补 DNA(complementary DNA ， cDNA) ，再由 DNA 聚合酶合成双股 cDNA ，供构建用。 若将某种细胞中所有 mRNA 都抽提出来， 并制备成各自相应的 cDNA 。此包含某特定细 胞的全部cDNA克隆即为cDNA文库(cDNA library),由此建立的文库，包括了这种细胞所有 表达的基因的序列。与基因组文库不同点为 cDNA 不含内含子成分，也不含不转录的序列。 cDNA 文库中所含 cDNA 的情况也因不同组织细胞和不同发育阶段及不同生理状态而不同。3人工合成的 DNA 片段4聚合酶链反应 (PCR) 扩增 DNA 片段

39、或 cDNA以已有 DNA 为模板，通过 PCR 扩增出所需片段。另可以 mRNA 为模板，采用逆转录 酶 PCR 进行扩增，得到所需要的cDNA 。 (详见下节 )。(二 ) 载体欲将外源基因或 DNA 片段导入宿主细胞进行扩增或表达，需要通过一个能在宿主细胞中进行自我复制并表达目的基因的载体(vector)的介导，目的 DNA与载体在体外构成重组DNA 分子， 然后导入宿主细胞， 进行扩增及表达。 以大肠杆菌作为宿主细胞的载体有： 质粒、 入噬菌体、粘粒和 M13噬菌体等。这些载体分为克隆用和表达用不同种类，有些还含有在真 核细胞中生活及基因表达必须的成分，供不同实验目的选用，多数已作为商

40、品供应。1. 克隆载体 (vector of clone)(1)质粒质粒(plasmid)是细菌染色体外小的双链闭环的DNA分子，能自主复制，并含有抗药性基因。较理想的质粒应符合下列条件：1) 要有多个单切口的限制性内切酶的位点，而且外源 DNA 片段插入后，不影响质粒的 复制。2) 含有抗药性或其他可供筛选的标志，外源 DNA 插入后，抗药性消失，或其他酶活性 丧失。3) 含有高效的自主复制序列， 这样在宿主细胞中质粒复制的拷贝数多。 若含有能在真核细胞生活的序列，这种载体则能在真核细胞中生活及表达。pBR322 是一种最常用、最基础的质粒。通过人工构建而成，其结构如图 12-22 所示。大

41、小： 4363bp 抗药性基因：有两个。氨苄青霉素抗性(ampicillin resista nee ,ampR )基因编码3 -内酰胺酶(B -lactamase),能切开氨苄青霉素的内酰胺环，从而使之失效。若在此基因中插入外源 DNA 片段，即破坏该酶的结构。 另一四环素抗性(tetracycline resistanceamp基因，编码一种蛋白质，能改变细菌膜的状态， 阻止四环素进入细胞而赋予宿主抗四环素的能力。若该基因被外源DNA 插入即失活。自主复制(ori)成分(序列),使pBR322在大肠杆菌内能高效进行复制，产生多拷贝。另一些质粒如 pUC 系统,除含 ampr 基因外,还含大

42、肠杆菌的 lacZ 基因也常被用作为选 择的标记。此基因编码 3 半乳糖苷酶。 LacZ 位于多位点接头 (polylinker) 上。有的还含有高效 的启动子。(2) 入噬菌体 入噬菌体(bacteriophage入)为线状双链 DNA病毒(约50kb)，感染大肠杆菌。经改造的噬菌体有一、二个EcoR I切点，并含有 LacZ基因作为筛选的标志。当中的1/3序列不是病毒生活所必需，可以去除，而由外源DNA片段(525kb)替代。如图12-23所示。3 -半乳糖苷酶能分解一种化学品称为5-溴-4-氯-3 吲哚 -半乳糖苷 (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-galactos

43、ide , X-gal) , X 即为 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ,是一发色 (蓝色 )基团,当 它与半乳糖以糖苷键结合时即为无色。 但是 X-gal 经3 -半乳糖苷酶作用后即将X 基团释放出来而成蓝色。 若 LacZ 被插入的 DNA 片段破坏, 则不能产生 3 -半乳糖苷酶, 因此在含有 X-gal 的培养基中成为无色的斑点。若 LacZ 完整, X-gal 被3 -半乳糖苷酶分解而成为蓝色的斑点, 故可作为筛选的标志。(3) 其他2. 表达载体( expression vector) 表达载体是带有调控克隆基因表达必需的转录和翻译信号的克隆载体。克隆基因在细

44、菌和其它细胞中的过量表达,能够产生大量的特异蛋白质。(1)大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体(E.coli expression vector)除具有克隆载体所具备的性质以外,还带有控制在大肠杆菌中表达元件即转录和翻译所必需的DNA 序列 : 启动子、操纵基因、编码阻遏物的基因、核糖体结合位点、转录终止信号。( 2)真核表达载体 真核表达载体( eukaryotic expression vector )含有必不可少的原核序 列,如在大肠杆菌中能够作用的复制子,便于挑选带重组质粒细菌的抗生素抗性基因。但在质粒中还包括在真核细胞中生活和表达元件：启动子 / 增强子、克隆位点、终止信号和加 poly

45、(A) 信号、剪接供体和受体、复制起始点和选择标记基因。(三 ) 工具酶限制性内切酶 (restriction enzyme 或 restriction endonuclease)， DNA 连接酶、末端脱氧核 苷酸转移酶 (terminal deoxynucleotidyl transferase， TdT) 、逆转录酶、 S1 核酸酶 (切单链 DNA 或 RNA) 、碱性磷酸酶等均属工具酶。 限制性内切酶是重组 DNA 技术中最关键的工具酶， 现 着重加以介绍。限制性内切酶是微生物的一种自我保护的酶，它能识别双链 DNA 分子中特异碱基序列 并切开。 所以当外源 DNA 侵入细菌体时，

46、细菌体为保护自身 DNA 的完整性， 通过其所含的 特有的限制性内切酶对外源 DNA 进行酶解， 而自身的 DNA 分子中所含该限制性内切酶的识 别碱基序列则被另一种酶进行甲基化而保护起来，故不被自己的限制性内切酶所切断。 限制性内切酶识别的 DNA 序列多数为 46 个碱基，新近发现一些能识别 8 个碱基的。识别 碱基数少的酶对 DNA 切的机率多，碱基数大则少。所以识别 8 个碱基序列的酶，可用于分 析大片段 DNA ，可切成上百乃至上千 kb 的片段。限制性内切酶的识别序列都具有回文或双 重对称结构的特点。切口：有两种切口。一种切开后，即成黏性末端 (cohesive ends 或 st

47、icky ends) ，因为两个 末端的碱基互补配对，易通过氢键相连。有些限制性内切酶的切口，成为平头末端 (blunt ends)不同的 DNA 分子上若有某一种限制性内切酶的位点，均能被该酶切断，并产生相同的 切口，这对重组 DNA 分子很有利。拼接方法：1. 黏性末端2均聚体尾部 (homopolymeric tailing)3化学合成的接头 (chemical synthetic linker)三、重组 DNA 分子引入宿主细胞(一 ) 原核细胞最常用的是大肠杆菌，要选择合适的菌株(stra in)。宿主细胞先经氯化钙处理，以改变细胞膜的通透性， 使重组 DNA 分子容易进入。 这种将

48、重组质粒 DNA 分子引入细菌， 使其在细 菌体内扩增及表达的过程称为转化 (transformation) 。(二 ) 动物细胞宿主细胞主动摄取或被动引入外源 DNA 片段或重组 DNA 分子的过程称为转染 (transfection) 。进入细胞内的 DNA 可以被整合至宿主的基因组中， 也可以在染色体外生活表达， 这就需要采用含有能在真核细胞生活的结构成分的载体。可用磷酸钙介导 (calcium-phosphate mediated)使外源DNA形成沉淀颗粒，颗粒若沉着在动物细胞的表面，以利细胞将这些颗粒摄 入。近年用脂质体 (1iposome) 介导外源 DNA 的转移，可提高转染效率

49、。 用电穿孔 (electroporation) 方法，将外源 DNA 与宿主细胞放入特别的装置内，在高压电脉冲作用下，细胞外的DNA 分子会在细胞膜上穿孔而入，并最终进入细胞核内，整合至宿主基因组中。用基因枪(颗粒轰击 particle bombardment)方法是将外源 DNA包裹了化学性质稳定的金或钨微粒以后，在电子发 射装置或高压气流的驱动下， 以极高速度打入受体细胞， 组织和器官中， 以进行基因转移技术。用逆转录病毒(retrovirus)作为载体可以成功地感染动物细胞。另外可用微注射 (microinjection) 的方法，将外源 DNA 分子直接注射入细胞内或核内。近年发展一

50、种转基因 (transgenic)小鼠方法，即将重组DNA分子注射于单细胞受精卵的原核内，然后再将其植入一假妊娠母鼠的子宫内。生下的小鼠在全身各组织细胞的基因组DNA 中都含有这种外源DNA ，可以研究在整体条件下外源 DNA 的功能。四、筛选(一 ) 根据选择标志含有重组质粒 DNA 菌落的选择，主要可借用抗药性标记来筛选。例如，某一外源DNA片段，插在pBR322的Pst I位点，根据转化的情况，可以筛选被重组质粒转化的菌落。没有转 化的细菌在含有氨苄青霉素或四环素的培养基中都不能生长；被重组质粒转化的细菌，在含 有四环素的培养基中能生长，而在含有氨苄青霉素的培养基中则不能生长。未被重组的

51、 pBR322 质粒转化的细菌则在这两种培养基中均能生长。因此，根据菌落的不同抗药性可以 筛选出含有重组质粒的菌落。同理可以筛选出插入在四环素抗药性基因的质粒。常根据噬菌体所含的 LacZ 基因是否被插入片段破坏来筛选。 无色的噬菌斑表示 LacZ 被 破坏， 即这种噬菌体含有外源 DNA 。蓝色的噬菌斑， 表示 LacZ 不被破坏， 即不含插入片段。(二 ) 菌落或噬菌斑原位斑点杂交用标记的已知 DNA 或 RNA 作为探针，来筛选所要的克隆 (详见下述 )。(三 ) 蛋白质表达产物的测定 可以用放射免疫方法来筛选，即先制备所要研究的蛋白质的抗体，再用放射性核素标记 该抗体。若某一菌落或噬菌

52、斑表达该种蛋白质，如原位杂交方法一样，先将其转移至膜上， 再与放射性核素标记的抗体杂交。产生该蛋白质的菌落或噬菌斑，因抗体抗原的特异结合反 应，又因抗体带上核素，所以经放射自显影术后会出现黑斑点。五、一些常用的分子生物学技术( ) 核酸分子杂交核酸分子杂交 ( molecular hybridization of nucleic acid )指序列互补单链的 RNA 与 DNA 、 DNA 与 DNA 或 RNA 与 RNA ，根据碱基配对原则以氢键相连而形成杂交分子的过程。需要 有一合适的探针(probe), 一般指一段己知序列的DNA或RNA或化学合成的寡核苷酸。标记的探针与待测样品的 D

53、NA 或 RNA 杂交，从而判断二者的同源性。 若用标记的探针，在组织 或细胞水平与细胞内的 RNA 或 DNA 进行杂交， 则称为组织或细胞原位杂交。 在染色体水平 进行原位杂交则可测定某基因在染色体的定位。1. DNA 印迹DNA印迹(Southern blot)是由英国科学家 E, Southern于1975年提出的一种检测基因组 DNA 中特异序列的方法， 故以作者的姓氏命名， 此方法广泛地应用于分子生物学的研究， 可 以分析基因的结构、同源性和基因的拷贝数等。本方法基本步骤：将高分子量 DNA 用合适的限制性内切酶酶解成一定的片段,进行琼 脂糖凝胶电泳分离；电泳后用碱处理,使凝胶中的

54、 DNA 变性成单股 DNA ,转移至硝酸纤维 滤膜或尼龙膜上,并固定之；选择一合适的探针,用放射性核素或非核素标记方法,如生物 素、地高辛 (digoxigenin) 等标记之,进行分子杂交；滤膜经放射自显影 (autoradiography) 处理 后,即可得杂交 DNA 条带的放射自显影图,如图 12-26 所示。若用其他非核素标记的探针, 可用相关方法使之产生色带或发光带。2 RNA 印迹RNA印迹(Northern blot)方法主要是用来检测特异mRNA的表达情况及 mRNA分子的大小，特别是用于研究细胞生长、分化、发育过程中有关基因的表达或组织细胞在病理条件下(如恶性肿瘤)某些基

55、因的表达异常。由于DNA印迹方法以作者 Southern(南)命名，故此方法则便称为 Northern ( 北) blot。基本步骤是：先提取完整 RNA ；再进行 RNA 变性琼脂糖凝胶电泳，变性条件下可破坏RNA 的局部双螺旋，使其成线状单链，有利于杂交及分子大小的判断；其它步骤的原理与Southern 印迹相似。3斑点杂交( dot hybridization )(1) DNA 和 RNA 斑点杂交直接将变性 DNA 或 RNA 点样于硝酸纤维薄膜上，晾干后与放射性核素标记的探针 进行杂交及放射自显影， 以观察所要研究的基因或 mRNA 是否存在， 并可以比较相对量的高 低。(2) 菌落和噬菌斑原位斑点杂交 上述构建基因组克隆文库和 cDNA 克隆文库，若要从文库中筛选出某特异克隆，常用菌 落或噬菌体斑原位斑点杂交( in situ dot hybridization )将一大小相当的硝酸纤维滤膜放置于 生长众多的细菌集落或噬菌体斑的主平板上(master plate),使每一集落的细菌或噬菌体斑转移至滤膜的相应位置，然后使细菌裂解，释放出的 DNA 固定于滤膜，则可与放射性核素标 记的探针杂交及放射自显影,根据杂交斑点的