荧光探针定量PCR检测HBV-DNA_第1页
荧光探针定量PCR检测HBV-DNA_第2页
荧光探针定量PCR检测HBV-DNA_第3页
全文预览已结束

下载本文档

版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领

文档简介

1、荧光探针定量PCR检测HBV-DNA赖宏芳付晓野董玉琳邓志军 摘要本文采用荧光探针定量(FQ-PCR)法准确定量检测HBV-M阳性标本中的HBV-DNA数量。结果显示:HBeAg(+)组(32份)的阳性率为100%,HBV-DNA拷贝数范围在105109/ml之间。HBeAb(+)组(47份)的阳性率为23.4%,HBV-DNA拷贝数范围在103105.7/ml之间;HBsAb(+)组(37份)的阳性率为2.7%,HBV-DNA拷贝数为105/ml。以上44例HBV-DNA阳性拷贝数范围在103109/ml之间。HBeAg(+)组血清中HBV-DNA含量(107.091显著高于HBeAb(+)

2、组(104.71)和HBsAb(+)组(105)。结果表明:HBV-DNA的FQ-PCR检测较常规PCR更具有较高的灵敏度和特异性,且定量准确,结果可靠,能避免PCR后处理污染导致的假阳性,可反映HBV真实感染和低复制状态。结合HBV-DNA含量测定判断HBV病毒复制状态,对临床诊断、治疗及判断预后具有重要的指导意义。 关键词乙型肝炎病毒荧光探针定量-聚合酶链反应脱氧核糖核酸 常规PCR技术因存在扩增产物污染、所用染色剂溴化乙啶是强烈致癌物,以及临床不能准确定量等缺点。为此,本文采用FQ-PCR法,以克服常规PCR的不足。对116例ELISA法检测的乙肝血清标志物(HBV-M)阳性的标本进行H

3、BV-DNA测定,以探讨FQ-PCR技术在HBV病原体感染诊断中的临床应用价值。 材料和方法 一、材料和仪器116份经HBV-M检测阳性的血清,HBV-M ELISA试剂盒,厦门新创科技公司提供。FQ-PCR试剂盒,中山医科大学达安基因诊断中心提供。检测仪器为PE7700自动荧光PCR仪(美国PE公司)。 二、检测方法FQ-PCR法是在常规PCR基础上,添加了一条标记荧光发光分子和一个荧光淬灭分子的双标记探针,前者标记5端,后者标记在3端。完整的探针在激光激发下,发光分子所产生的荧光被淬灭分子全部吸收,从而无荧光。PCR扩增中Taq酶在链延长过程中可以通过自身的53核酸外切酶活性而降解,与模板

4、结合的特异性荧光探针(切口平移效应)2,使得荧光发光分子从探针上切下,而与荧光淬灭分子分开,从而在激光激发下产生特定波长的荧光。这种荧光随着PCR扩增过程而动态性增强。FQ-PCR仪通过全过程动态监测可以得到每一个样品实际扩增曲线以找到PCR扩增的对数期,比较标准样品(单位:拷贝数/ml)的对数期,得出每一样品特定模板DNA的起始拷贝数/ml。 定量范围为01010/ml,定量准确度为100%。 本法操作是用常规的碱裂解法从血清中提取HBV-DNA。各反应管放入PE7700自动荧光检测仪,按下列条件扩增:93 2 min预变性,然后按照9345 s,55120 s,共经40个循环后,由仪器软件

5、自动分析计算出定量结果。 定量结果采用计算对数平均值的方法来计算HBV-DNA平均拷贝数,遇有阴性结果,不参加平均值的统计。其单位采用:拷贝数/ml。 结果 116例HBV-M阳性标本用FQ-PCR检测HBV-DNA含量详见附表:检测HBV-DNA拷贝数范围在103109/ml之间。 附表FQ-PCR检测的HBV-DNA含量(s) 组别 例数 阳性数(%) HBV-DNA (以指数表示) P值(与1比) 1.HBsAg+/HBeAg+/HBcAb+ 32 32 (100) 7.091.03 2.HBsAg+/HBeAb+/HBcAb+ 47 11 (23.4) 4.71 0.01 3.HBsA

6、b+ 37 1 (2.7) 5 0.01 注:各组拷贝数范围为:101.96s/ml HBeAg(+)组HBV-DNA拷贝数范围在105109/ml之间,其HBV-DNA含量显著高于HBeAb(+)组与HBsAb(+)组 HBeAb(+)组11例HBV-DNA拷贝数范围在103107/ml之间。 HBsAb(+)组只检出1例HBV-DNA拷贝数为105/ml。 讨论 荧光探针定量PCR技术融汇PCR和DNA探针杂交技术的优点,直接探测PCR过程中荧光信号的变化,根据PCR反应的酶动力学特点,获得DNA模板的准确定量结果。该技术整个实验过程均在完全闭管的状态下进行,无需PCR后处理和冗长的电泳、

7、紫外或染色检测,解决了常规PCR实验不能准确定量及扩增产物污染而导致的假阳性,操作繁复以及强烈致癌物溴化乙啶对操作人员的危害和污染环境等问题,成为常规PCR的更新换代技术。 本文采用的FQ-PCR试剂盒用中国药品生物制品检定所的灵敏度标准品测试,灵敏度可达到0.01 fg/ml,相当于2.5个HBV Dane颗粒/ml,其灵敏度亦高于常规PCR的102103个拷贝/ml。 FQ-PCR可以准确定量出01010个拷贝的病原体,定量范围极宽,具有重要的临床诊断价值。以乙肝为例,HBsAg强阳性的血清中可测出高达105109病毒颗粒,随着治疗的进程,病毒拷贝数逐步减少,部分病人完全转阴,多数病人在H

8、BsAg转阴后HBV DNA仍呈阳性。据此,可建立乙肝治愈与否的分子诊断标准。而PCR定性测定难以得出治愈与否的判定。 FQ-PCR法采用实时检测技术,可以得到每一个样品实际扩增曲线以找到PCR扩增对数期,以标准品比较,所得值与原始模板数量呈线性相关,定量准确率较高。有资料显示:常规PCR在实验过程中,影响实验结果的因素很多,在实验中没有对照标准,故其结果很难重复3。此外常规PCR法的定量是针对PCR终产物进行的,其平台效应大为干扰了PCR的原始数量和终产物之间的相关性,使定量准确度难以提高4。 本文结果显示:标志感染期HBeAg(+)组:FQ-PCR定量的平均拷贝数为107/ml,标志恢复期

9、HBeAb(+)和HBsAg(+)组:FQ-PCR定量的平均拷贝数为104.7/ml和105/ml,以上结果表明:FQ-PCR可以清楚反映乙肝患者的病程变化情况及真实反映HBV的感染和复制情况。进而用于临床诊断、治疗和疗效观察,将有较高的临床应用价值。 赖宏芳(昆明市延安医院650051) 付晓野(昆明市延安医院650051) 董玉琳(昆明市延安医院650051) 邓志军(中山医科大学达安基因诊断中心) 参考文献 1张复春,吴婉芬,董惠卿,等中华传染病杂志,1997;15(1)24 2Holland P M,Abramson R D,Watson R, et al. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5to 3exonuclease a

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

评论

0/150

提交评论