人脐带静脉灌注液间充质干细胞的分离和鉴定

1、    作者：刘晓丹，刘兵，李秀森，毛宁【摘要】  本研究旨在探讨人脐带静脉灌注液中是否存在间充质干细胞及其分离和扩增方法。从正常产妇分娩后的脐带静脉灌注液分离间充质干细胞，观察细胞形态并用流式细胞仪分析其细胞表型和细胞周期，在体外分别诱导其成骨、成脂肪和成软骨细胞分化。结果表明：脐带静脉灌注液来源的间充质干细胞为成纤维细胞样，高表达CD29、HLAABC、CD166、CD105、CD73、CD44；不表达造血和内皮标志（CD34、CD45、CD144和CD14）。它们可向骨、脂肪和软骨细胞分化，符合间充质干细胞的基本功能特征。结论：

2、人脐带静脉灌注液存在间充质干细胞，能够在体外培养和扩增，可作为今后细胞治疗和组织工程的种子细胞。 【关键词】  脐带静脉灌注液     Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells from Perfusion of Human Umbilical  Cord Vein      Abstract    This study was aimed to investigate whether m

3、esenchymal stem cells (MSCs) existed in human umbilical cord vein and to establish the methods of isolation and expansion in vitro. The MSCs direved for perfusion of umbilical cord vein (UVMSCs) were collected after parturition of Healthy pregnant women. The morphology of MSCs and their differentiat

4、ion potential into osteoblast, adipocyte and chondrocyte were observed the phenotype and cell cycle of MSCs were determined by using flow cytometry. The result showed that the mesenchymal stem cells separated from umbilical cord  vein gave rise to a population of adherent cells with a typi

5、cal fibroblastlike morphology. Similarly to bone marrowderived MSCs,  they highly expressed CD29, HLAABC, CD166, CD105, CD73 and CD44, and were negative for any hematopoietic and endothelial markers (CD45, CD34, CD14 and CD144). Functionally, they could differentiate into the osteoblast, a

6、dipocyte and chondrocyte. It is concluded that  MSCs exist in the human umbilical cord vein perfusion.  Their read amplification in vitro contribute to  clinical applications for cell therapy and tissue engineering.    Key words    mesenchymal stem c

7、ell; umbilical  cord vein perfusion; cell  isolation; cell identification    间充质干细胞（mensenchymal stem cells,  MSC）最早自骨髓中分离，是一类具有自我更新及多向分化潜能的  中胚层源干细胞1。作为多种骨髓基质的前体细胞，MSC能通过调节造血微环境以促进造血干细胞增殖、分化，它亦能调节淋巴细胞免疫功能，从而减轻移植排斥反应等生物学效应2。MSC的发现为针对性解决造血干细胞移植，尤其是脐血移

8、植中的干细胞数量相对不足及减轻移植物抗宿主病提供了一个有效手段3，4。然而，临床上骨髓取材困难，供体有限，随年龄的增加其增殖和分化能力下降，且有病毒污染的可能5 。因此，寻找MSC的新来源具有重要意义。本研究从易于获取、且组织来源较为原始的脐带静脉灌注液中寻找MSC（UVMSC），并对其进行生物学特性的鉴定。    材料和方法    材料与试剂    脐带来自北京市中西医结合医院正常分娩产妇，均经父母授权同意。胶原酶为Sigma公司产品，DMEM为Hyclone公司产品，胎牛血清为FBS，Stem Cell产品，L谷氨酰胺为Amres

9、co公司产品，EGF为Peprotech公司产品，rhVEGF为RD公司产品，bFGF为双鹭药业公司产品，胰蛋白酶为Amresco公司产品，诱导试剂：地塞米松、甘油磷酸钠、抗坏血酸磷酸盐、3异丁酸1甲基黄嘌呤（IBMX），胰岛素、消炎痛、丙酮酸钠均为Sigma公司产品，TGF3为RD公司产品，ITSA为Sigma公司产品；流式相关鼠抗人单克隆抗体：CD29PE、CD166PE、 CD14、CD144PE、CD34FITC、CD45FITC、HLAABCFITC、HLADRFITC、CD44FITC、CD105FITC均为Becton Dickinson公司产品），碱性磷酸酶检测试剂盒为Sigm

10、a公司产品。    中国实验血液学杂志  J Exp Hematol 2007; 15(5)人脐带静脉灌注液间充质干细胞的分离和鉴定UVMSC的分离培养与传代    取正常产妇分娩后的脐带静脉，无菌条件下用PBS清洗脐带静脉外表面及脐带静脉，止血钳夹住一端，根据脐带静脉的长度，加入适量的0.1% 型胶原酶，37孵育30分钟，弃去脐带静脉内液体，用PBS灌注脐带静脉3次，收集灌注液，按1×105/cm2,接种于25 cm2的塑料培养瓶中，培养体系为： 10% FBS、MEM、EGF（10 ng/ml）、rhVEGF（10 ng

11、/ml），青霉素（100 U/ml ）、链霉素（100 U/ml ）、L谷氨酰胺2 mmol/L，置于37和5% CO2条件下孵育72小时后换新鲜培养液，待细胞融合达80%以上，加入0.05%胰蛋白酶EDTA溶液消化，按13或14传代。待3代后，细胞形态呈纤维细胞状，可停止加入EGF和VEGF。取3代以上细胞作后续试验。    UVMSC 表面抗原的检测    取第5代处于对数生长期UVMSC，按每管2×105个细胞，依次加入10 l鼠抗人单克隆抗体CD29PE、CD166PE、CD73PE、CD14PE、CD144PE、CD34FITC、CD

12、45FITC、HLAABC、HLADR、CD44FITC、CD105FITC，另设1管为对照组，室温避光30分钟；用PBS反复洗2-3次，减少非特异性结合；离心后，加入1%多聚甲醛固定，4保存，1周以内进行流式细胞仪检测。    UVMSC的细胞周期检测    收集对数生长期UVMSC 1×106，PBS洗2次，0.9% FBS的70%乙醇重悬，4保存过夜，然后用PBS洗2次，加1 mg/ml RNase于37孵育30分钟，加入150 g/ml PI,室温避光20分钟，上流式细胞仪进行细胞周期检测。    UVMSC的生长曲

13、线检测    收集UVMSC细胞，按每孔500个细胞接种于96孔板内，每组3个复孔，待24小时后，加入MTT 20 l，4小时后加入100 l裂解液，于37过夜，第2天用酶联仪测定OD540，连续测定6天。    定向诱导UVMSC向成骨细胞分化的方法与鉴定    收集消化后UVMSC，按3 000/cm2接种于6孔板内，成骨的诱导体系为：地塞米松0.1  mol/L、甘油磷酸钠10 mmol/L、抗坏血酸磷酸盐50 mol/L、10% FBS、高糖DMEM，每3天全量换液，维持3周，然后进行碱性磷酸酶检测，方法同

14、文献6。    定向诱导UVMSC向脂肪细胞分化的方法与鉴定    收集UVMSC后按9 000/cm2接种于6孔板内，待细胞贴壁后，加入脂肪诱导体系:地塞米松1 mol/L、IBMX 0.5 mol/L、消炎痛200 mol/L、10% FBS、高糖DMEM，每3天全量换液，维持3周，然后进行油红染色，显微镜下观察细胞内脂肪小滴形成情况。    定向诱导UVMSC向软骨细胞分化的方法与鉴定    收集第3代到第5代细胞，取2×105细胞放于15 ml塑料管内，300×g离心10分钟，弃上清液，

15、加入0.5 ml软骨培养体系，包括：  ITSA 5 l、地塞米松0.1 mol/L、抗坏血酸磷酸盐50 mol/L、丙酮酸钠1 mmol/L、TGF3 10 ng/ml、高糖DMEM补足0.5 ml。每3天全量换液，培养3周后，石蜡包埋，切片，进行甲苯胺蓝染色鉴定。    结    果    形态学观察    型胶原酶消化的细胞接种72小时后全量换液。此时可见少量形态各异的细胞贴壁，散在分布。1周左右，贴壁细胞形成集落，绝大多数细胞呈纺锤形或成纤维样细胞，与骨髓来源的MSC形态相似。细胞折光性

16、较好，核仁明显，胞体较骨髓MSC大，且胞体较宽（图1A）。同时可见少量鹅卵形细胞，可能为脐带静脉内皮细胞。约14天后，细胞可长至80%-90%融合，用0.05%胰蛋白酶EDTA消化。传代1-2次后，细胞形态变得较为均一，脐带静脉    Figure 1. Morphology of MSCs from perfusion of umbilical cord vein (UVMSC). A: UVMSC  in primary culture for one week.  B:  UVMSC at passage 5

17、, reaching a 100% confluence and forming a vortex arrangement(10×10).    内皮细胞得到抑制。将培养液更换为含有bFGF(10 ng/ml)、2 mmol/L谷氨酰胺的10% FBS的MEM。细胞长100%融合时，细胞呈漩涡状（图1B），细胞可培养20代以上。    UVMSC的免疫表型分析    对第5代UVMSC进行流式细胞术检测，结果发现UVMSC高表达CD29、HLAABC、CD166、CD105、CD73、CD44，不表达CD34、CD14、HL

18、ADR、CD45、CD31、CD144（图2）。这表明人脐带静脉灌注液来源的MSC不表达造血前体细胞标志CD34、白细胞抗原CD45、单核细胞/巨噬细胞表面抗原CD14，也不表达内皮细胞表面抗原CD31、CD144，这证明脐带静脉灌注液来源的MSC为非造血、非内皮类细胞。MSC表达的表面标志具有非单一性，即CD29、    Figure 2. FACS analysis of CD166、CD105、CD73、CD31、CD29、CD144、CD34、HLAABC、CD45HLADR、CD44 from UVMSCs at passage 5.    C

19、D44、CD73、CD105、CD166等，与骨髓、脐血等其它组织来源的MSC的流式细胞术检测结果一致，说明脐带静脉灌注液来源的成纤维样细胞是一群细胞形态均一，且与骨髓来源的MSC有同源性的细胞。    UVMSC的细胞周期检测    取第5代细胞进行细胞周期检测，发现有73.72%的细胞阻滞于G0/G1期，与骨髓及脐血来源的MSC一致。     UVMSC的细胞生长曲线    取第5代细胞进行生长曲线测定，发现UVMSC的倍增时间为31小时，培养6天后其OD值增加24倍，说明是一群增长旺盛的细

20、胞（图4）。     成骨诱导分化结果    UVMSC成骨诱导分化3周后，细胞胞体变宽，呈多边形，且碱性磷酸酶酶染色为阳性(图5 A)。    成脂肪诱导分化结果    UVMSC成脂肪诱导分化3周后，细胞胞浆内出现脂肪小滴，油红染色为阳性(图5B)。    成软骨分化结果    UVMSC成软骨分化3周后，甲苯胺蓝染色阳性(图5C)。    讨    论    干细胞移植是一种新兴的治疗手段。

21、MSC一类具有自我更新及多向分化潜能的组织干细胞，在特定条件下向成骨、成脂肪、成软骨及神经细胞分化。作为多种骨髓基质的祖细胞，MSC还具有稳定和修复造血微环境，促进造血干细胞增殖、分化，调节淋巴细胞免疫功能，减轻移植排斥反应等生物学效应2。MSC最早发现于骨髓，但骨髓来源困难，且骨髓MSC随年龄增加其分化及增殖能力均减弱，因此寻找新的来源有重要意义。骨髓、脐血以及多种实质器官（肝脏、肾脏及肺脏等）均能分离出MSC。通过上述工作，我们在脐带静脉灌注液内成功分离到间充质干细胞，后者在散在分布时呈纤维细胞状，当100%接触时呈漩涡状，其73.72%的细胞阻滞于G0/G1期，强表达CD29 、HLAA

22、BC 、CD166 、CD105、CD73、CD44，不表达造血及内皮标志，同时可以在体外向成骨、成脂肪、成软骨细胞分化，与骨髓MSC一致。这些结果说明，我们在人脐带静脉灌注液获得了一群形态均一，可在体外进行稳定分离、大量扩增、并且可多向分化的间充质干细胞。与我们以往分离的骨髓来源的MSC相比，两者细胞形态、表面标志和分化特性相似，均可向成骨、成软骨及成脂肪细胞分化，且UVMSC细胞周期和诱导成骨的时间长于骨髓来源的MSC，更易向成脂肪细胞分化。这也证实了成体干细胞的理论，即在成体多种组织中都存留有间充质干细胞，它们是胚胎发育过程中存留于各种组织中的。脐带静脉作为分娩废弃物来源广泛、取材方便、不受伦理限制，因此将其作为MSC的新来源，则对基础研究和临床应用很有意义。【参考文献】  1Caplan