SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量ppt课件

1、SDS-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳生化社团生化社团吕炎吕炎SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量 v一、实验目的v二、实验原理v三、实验步骤v四、结果分析v五、本卷须知一、实验目的v学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理。v掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术。二、实验原理vSDSSDS的性质与作用的性质与作用v聚丙烯酰胺凝胶的性质聚丙烯酰胺凝胶的性质SDS的性质与作用的性质与作用十二烷基磺酸钠(SDS) Sodium dodecyl sulphate CH3-(CH2)10-CH2OSO3-Na+-SDS的性质与作用的性质与作

2、用u 蛋白量变性u 0.1-1% SDSu 0.1 M 2-巯基乙醇u蛋白量变与SDS分子按比例结合u 1 ：1.4SDSSDS的性质与作用的性质与作用聚丙烯酰胺凝胶性质v聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是由丙烯酰胺Acr和甲叉双丙烯酰胺Bis在催化剂的作用下，聚合交联而成的。 v聚丙烯酰胺凝胶(PAG)具有三维网状构造，能起分子筛作用。用它作电泳支持物，对样品的分别取决于各组分所带电荷的多少及分子大小。v聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)还具有浓缩效应，即在电泳开场阶段，由于不延续pH梯度作用，将样品紧缩成一条狭窄区带，从而提高了分别效果。聚丙烯酰胺凝胶性质XYZ+ SDSPAGESDS-PAGEXYZ

3、-+-结果受分子量大小和电荷的影响结果受分子量大小和电荷的影响结果只与分子量大小有关结果只与分子量大小有关-+PAGE和SDS-PAGE的比较三、实验步骤v制备分别胶v制备浓缩胶v电泳及染色v凝胶板剥离与染色配制分别胶溶液v制备分别胶制备分别胶凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再参与。注胶过程要一次性完成,防止产生气泡。出现明显界面时，出现明显界面时，分别胶凝聚完成分别胶凝聚完成 minh倒出水或正丁醇，倒出水或正丁醇，并用滤纸吸干并用滤纸吸干v制备分别胶制备分别胶封水的目的是使分别胶上外表平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间构成明晰的界面。配制浓缩胶溶液v制备浓缩胶

4、制备浓缩胶参与浓缩胶溶参与浓缩胶溶液液 pH 8.6v制备浓缩胶制备浓缩胶样梳需一次平稳插入样梳需一次平稳插入,梳梳口处不得有气泡口处不得有气泡,梳底需梳底需程度。程度。插入样品梳插入样品梳v上样及电泳上样及电泳凝胶板剥离与染色v电泳终了后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标志后放在大培育皿内，参与染色液，染色1小时左右。v脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带明晰。v剥胶时要小心,坚持胶完好无损,染色要充分.影响电泳速度的外界要素v1.1.电场强度电场强度 v2.2.溶液的溶液的pHpH值值 v3.3.溶液的离子强度溶液的离子强度 v4.4.电渗景象电渗景象 v5.5.

5、温度的影响温度的影响 v6.6.支持物的影响支持物的影响 四、结果分析 标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。= 蛋白样品距加样端迁移距离（cm）溴酚蓝区带中心距加样端距离（cm） 相对迁移率 以每个蛋白规范的分子量对数对它的相对迁移率作图得规范曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量。 五、本卷须知v1.丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，操作时应免避沾在脸、手等皮肤上。最好戴一次性塑料手套操作。v2.过硫酸铵的主要作用是提供自在基引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合反响，故一定要新颖，储存过久的过硫酸铵商品不能运用。此外，10%过硫酸铵必需现用现配，4冰箱储存不超越48小时。v3.灌制凝胶时，应防止产生汽泡，由于汽泡会影响电泳分别效果。v4.刚灌注分别胶混合溶液后，应在分别胶液面上加12cm高的水层，以阻隔空气。胶液面上加水层时要特