局部晚期宫颈鳞癌流式细胞术分析与放射治疗预后的关系

1、局部晚期宫颈鳞癌流式细胞术分析与放射治疗预后的关系        【摘要】     目的 研究局部晚期宫颈鳞癌流式细胞术分析结果（DNA倍体、SPF和PI）与放疗预后的关系，探讨它们在预测宫颈癌放疗效果中的价值。方法 68例B期宫颈鳞癌病人在放疗前钳取宫颈癌组织，制备成单细胞悬液，采用流式细胞术检测癌细胞DNA倍体、S期比例（SPF）及增殖指数（PI），分析他们及其他临床参数与患者根治性放疗后疾病复发和生存的关系。结果 在68例标本中，异倍体检出率为47.1（32/

2、68），SPF和PI值为分别为(7.49±2.91)和(12.89±3.75)；在随访期间，全组宫颈癌患者复发率为44.1%(30/68)；二倍体组和异倍体组的5年无复发生存率分别为52.7%和35.2%（P<0.05），高SPF组和低SPF组5年无复发生存率分别为25.3%和56.6%（P<0.05），高PI组和低PI组5年无复发生存率分别为37.5%和49.3%（P<0.05）；经多因素分析显示，肿瘤大小和SPF是影响宫颈癌患者无复发生存的独立预后因素。结论 通过流式细胞术检测宫颈癌组织SPF可以预测局部晚期宫颈鳞癌放射治疗后的预后。  &#

3、160;  【关键词】  宫颈癌 流式细胞 DNA倍体 S期比 预后        恶性肿瘤细胞DNA含量变化是恶性肿瘤的重要生物学特性之一，对肿瘤组织DNA含量各种参数的检测，不仅能反映肿瘤细胞DNA含量的变化，还可以反映细胞的增殖活性，为预测恶性肿瘤的预后，制定个体化治疗方案提供重要信息。本研究采用流式细胞术检测局部晚期宫颈鳞癌细胞DNA倍体、SPF和PI，探讨他们及其他临床指标与宫颈癌患者根治性放疗后疾病复发和生存的关系。    1  资料和方法&#

4、160;   1.1  资料     1999年4月2001年3月在华中科技大学同济医学院附属同济医院行根治性放疗的宫颈癌病人68例。纳入本研究的患者应符合如下条件：(1)诊断均经病理学检查证实为鳞癌；(2)国际妇产科联盟（FIGO）临床分期为B期；(3)初治病人，以前未行针对宫颈癌的抗肿瘤治疗（包括放疗、化疗、手术和免疫治疗）；(4)一般状况能够耐受宫颈癌根治性放疗，(5)同意取材进行流式细胞术检测。全组患者年龄2372岁，中位年龄51岁。肿瘤最大径<4cm者35例，4cm者33例。末次随访时间到2004年12月，中

5、位随访时间42（665）月。    1.2  方法    治疗方法：全组病人都接受根治性放射治疗（体外照射加腔内治疗）。体外照射采用能量15MV直线加速器治疗，腔内治疗用Micro Selectron高剂量率192铱后装机治疗。放疗期间同步采用每周1次顺铂增敏化疗（每周25mg/m2）。    流式细胞术检测：病人在放射治疗前钳取宫颈癌组织，立即将癌组织置于干净的平皿上，加数滴PBS，用手术刀将组织块剁碎至匀浆状，通过400目尼龙网过滤，将过滤液转入离心管中，PBS洗涤2次（800r/min离心

6、5min），75%冰乙醇固定过夜。取固定细胞，PBS洗涤2次（同上），加PBS制成单细胞悬液（细胞数约106/ml），加RNA酶（终浓度为100g/ml）和碘化吡啶（终浓度为50g/ml），室温避光放置30min，上机检测（美国BectonDickinson公司FACSort型流式细胞仪），数据获取用CELLQest软件，细胞周期分析用ModFit2.0软件。    1.3 结果判定    (1) DNA倍体的判定：计算DNA指数（DI）。DI肿瘤细胞G0/G1峰的均道值/正常细胞G0/G1峰的均道值。二倍体肿瘤DI为0.901.10

7、；四倍体肿瘤DI为1.902.10；多倍体肿瘤DI >2.10。(2) SPFS/(G0/G1+S+G2/M)×100%。(3) PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)。    1.4  统计学分析     所有数据均采用SPSS10.0统计分析软件包根据数据特征进行处理。计量资料采用t检验、计数资料采用2检验；生存情况使用KaplanMeier法绘制生存曲线，并用logrank检验。采用COX风险模型进行多变量统计，分析各变量的独立性。检验水准以P<0.05为有统计学意义。&#

8、160;   2  结果     2.1  宫颈癌细胞周期检测结果    通过细胞周期分析，68例宫颈癌组织中，二倍体检出36例，检出率为52.9%；异倍体检出32例，检出率为47.1%。S期细胞比例（SPF）为(7.49±2.91)。增殖指数（PI）为(12.89±3.75)。    二倍体组SPF的值为(6.50±2.18)，异倍体组SPF的值为(8.62±3.24)，经t检验，两组SPF差异有统计学意义（P<0.0

9、1）。    二倍体组PI值为(11.89±4.04)，异倍体组的PI值为(14.02±3.08)，经t检验，两组SPF差异有统计学意义（P<0.05）。    2.2  DNA倍体与宫颈癌放疗后复发和生存的关系    在随访期间，全组宫颈癌患者中有30例在治疗后不同时间复发，复发率为44.1%(30/68)。二倍体组复发率为36.1%(13/36)；异倍体组复发率为53.1%(17/32)，经2检验，两组间差异无统计学意义（21.98,P>0.05）。进一步比较

10、两组的生存曲线，二倍体组5年无复发生存率为52.7%，异倍体组为35.2%，经logrank检验，差异有统计学意义（P<0.05），见图1。    图1  二倍体和异倍体宫颈癌患者的无复发生存曲线    Fig 1  Recurrent free survival curves according    to ploidy status in cervical cancer tissues    2.3  SPF与宫颈癌放疗后复发和生存的关

11、系    根据SPF的检测结果，将小于均值者归入低SPF组，否则归入高SPF组，其中高SPF组占39.7%（27/68）。高SPF组复发率为63.0%，明显高于低SPF组的31.7%（26.45,P<0.05）。比较两组的生存曲线，高SPF组5年无复发生存率为25.3%，低SPF组为56.6%，经logrank检验，有统计学意义（P<0.05），见图2。    2.4  PI与宫颈癌放疗后复发和生存的关系    根据PI的检测结果，将小于均值者归入低PI组，否则归入高PI组，其中高P

12、I组占39.7%（30/68）。高PI组的复发率为50.0%，低PI组复发率为39.5%。两组间差异无统计学意义（20.75,P>0.05）。比较两组的生存曲线，高PI组为37.5%，低PI组5年无复发生存率为49.3%，经logrank检验，无统计学意义（P0.05），见图3。    2.5  影响无复发生存率的多因素分析    将年龄、肿瘤大小、DNA倍体、SPF和PI等因素纳入多因素COX回归模型，分析显示肿瘤大小和SPF是影响宫颈癌患者无复发生存的独立预后因素，见表1。表1 68例局部晚期宫颈癌无复发生存资料多

13、因素COX回归分析    3  讨论    宫颈癌是我国女性最常见的恶性肿瘤之一，大部分患者就诊时已属于局部晚期，根治性放射治疗是这类患者的主要治疗手段，但复发率仍较高，5年生存率仅为36左右。如何识别一些复发高危患者，进行强化治疗，是降低复发的重要环节。    了解恶性肿瘤的生物学特性是有效防治恶性肿瘤的关键环节。越来越多的证据表明，肿瘤是一类细胞周期性疾病1。细胞周期机制的破坏是许多肿瘤的共同特征。组织细胞DNA含量多种参数的检测是研究肿瘤细胞生物学特性变化中非常有意义的工作。我们希望通过应

14、用流式细胞技术检测局部晚期宫颈鳞癌细胞DNA倍体、SPF和PI，探讨他们及其他临床指标与宫颈癌患者根治性放疗后疾病复发和生存的关系。    在人体体细胞中，除了肝脏、心肌和男性生殖细胞外，一般都有严格恒定的二倍体细胞DNA含量，而肿瘤细胞往往含有较多的DNA含量。据报道，大约有70%90%的肿瘤患者出现DNA异倍体细胞2，这反映了肿瘤细胞生物学特性从无到有的“质”的变化。同时，因为正常组织细胞都有一定的增殖活性，而恶性肿瘤细胞无限制生长，SPF及PI明显增加，又反映了细胞增殖活性从少到多的“量”的变化3。因此DNA倍体、SPF和PI是细胞周期的重要参数，他们可以反

15、映细胞的增殖情况。    许多研究发现，SPF的大小和异倍体与乳腺癌、胃癌、卵巢癌、大肠癌、淋巴瘤等肿瘤的预后相关，异倍体肿瘤及SPF高者，其预后较差48。然而，在宫颈癌研究中类似的报道多为回顾性研究，且结果不一致910。Tang等11对96例宫颈癌石蜡标本进行流式细胞术分析，结果提示，SPF与放疗后生存率无关，而DNA倍体与肿瘤的完全缓解率有关。Strang等12检测307例宫颈癌标本，结果发现SPF与患者的生存密切相关，但DNA倍体状况与预后无关。本实验结果为：b期宫颈鳞癌的DNA异倍体检出率为52.9%，单因素分析中提示DNA倍体和SPF与宫颈癌患者的无复发

16、生存率密切相关，DNA异倍体及高SPF组的5年无复发生存率明显低于二倍体及低SPF组。但在多因素分析结果中，只有SPF和肿瘤大小是影响宫颈癌患者无复发生存的独立预后因素。与大多文献报道相比，本研究对宫颈癌新鲜组织标本进行流式细胞术检测，变异系数较小，检测结果更准确；全组患者均为相同的临床分期和病理类型，混杂因素少，统计结果更可靠。    SPF对宫颈癌放疗预后的影响可能与S期细胞放射敏感差有关。早在1963年，Terasima等13 就发现在细胞周期的不同时相细胞对射线的敏感性不同。进一步研究表明，对射线最敏感的是M期细胞，G2期细胞较敏感，G1早期细胞相对敏感，

17、S 期细胞对射线呈抵抗性。作者在前期的研究中也得出类似的结果，在宫颈癌放疗过程中，SPF与宫颈局部肿瘤消退情况相关，SPF值越大，肿瘤消退越慢14,15。另外，肿瘤的大小与放疗敏感性有关，肿瘤越大，乏氧细胞的比例也越高，而乏氧细胞对射线相对抗拒。    综上所述，应用流式细胞术检测癌组织SPF，对局部晚期宫颈鳞癌预后的判断和治疗方法的选择有重要的指导意义，值得进一步研究和推广。    【参考文献】  1 Hartwell LH,Kastan KB.Cell cycle control and cancerJ.Sci

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