数量性状基因座(QTL)精细定位的研究进展

1、数量性状基因座(QTL精细定位的研究进展来源:卢超的日志本文转自博士论坛,希望与大家分享!生物界的许多性状是以数量性状为基础的,该类性状的发生不是决定于一对等位基因,而是受到两对或更多对等位基因的控制,每对等位基因彼此之间没有显性与隐性的区别,而是共显性。这些等位基因对该遗传性状形成的作用微小,所以也称为微效基因(minor gen e,它们在染色体上的位置称为数量性状基因座(quantitative trait loci, QTL。数量性状就是由许多对微效基因的联合效应造成的一类具有正态分布特性的性状,具有这种性状的个体在正态分布中的位置决定于它们所具有的微效基因的多少。数量性状之所以复杂,

2、是因为这种性状与基因型之间没有一一对应的关系,并且环境因素对它有显着的影响1。1961年,Thoday首次利用一对侧翼标记定位一个QTL2,随后QTL的研究得到飞速发展。现已证明,只要是控制连续分布性状的数量性状基因座,就能在实验群体或远交群体中定位3 。在整个QTL的研究中,可分为发现QTL,QTL的定位估计和精细定位4。Glazier认为可分成四个步骤:连锁和关联分析,精细定位,序列分析和候选基因的功能检测5。在模式生物小鼠的QTL研究,已描述的实验步骤更为详细6:第一,把QTL定位到染色体的区段上。典型的QTL定位方法须对几百个杂交后代进行恰当的表型检测;利用覆盖整个基因组的75-100

3、个遗传标记进行基因组扫描,遗传标记的平均跨度为15-20个厘摩(cM;准确基因分型,然后对性状和遗传标记之间进行连锁和关联分析;计算QTL与某标记位点靠近的可能性大小。这种方法即使经过成百上千次的表型和基因型的分析,定位的QTL在染色体上还是一个较大的区间。第二,把一个QTL的作用与其它QTL的作用分开。通常在同源系(congenic strain中进行,这样就把多基因遗传的性状转化成单基因性状进行研究。目标QTL与其它有作用的QT L分离后,仍须具有可测量的表型效应,否则达不到分离目的。该方法的局限性在于单个同类系不能分解几个连锁在一起的有相同作用的QTL,特别是该性状是由很多的基因控制的时

4、候。由于不知道单个QTL能否引起一个表型的可测量变化,使得进一步的工作更加困难7, 8。第三,QTL的精细定位。在开展分子水平的研究之前,尽可能把QTL所在的区间缩短至几个厘摩,甚至更小的范围内。这就需要大量的染色体片段的重组和可靠的表型测定,解决方法是构建一些特殊的实验群体,并对其中的特殊个体进行后代测试(progeny testing。第四,鉴定和评估候选基因。模式生物基因组测序的完成,提供了该基因的全部序列信息。但是对于QTL已经精细定位的遗传距离还显得太宽(1 cM 大约含有30个以上的基因。因此在对候选基因进行功能检测(functional test之前,必须清楚了解每个QTL对表型

5、的影响。第五,证实候选基因。一般用基因打靶或转基因的方法。QTL是在漫长的自然变异中形成的,研究QTL的最大挑战是要在两个亲本之间精确区分高度连锁在一起的多态性性状。要证明一个QTL性状是由某个等位基因引起,必须在主系(host strain中把该等位基因用其它基因替换并观察效应,这在技术上很困难,而且主系在很多情况下不是一个标准的近交系9 -12。以上几个步骤在QTL在研究过程中不是截然分开的。由于QTL研究能够定位基因,因此研究基因间的相互作用和功能,筛选和操纵农作物的重要经济性状,了解进化,为复杂遗传疾病提供新的诊断和治疗方法,在学术界引起了广泛的研究兴趣13。在过去的20年里,已在人类

6、、模式生物、植物中发现和定位了许多影响复杂性状的QTL。随着高通量的基因表达谱分析、新的分子遗传工具对基因组的操作、比较制图和复杂的统计软件的开发,使得QTL的精细定位和位置克隆成为可能。本文将对QTL精细定位的研究进展进行综述。(一QTL精细定位的基本策略与方法QTL的初步定位在染色体上是一个比较宽的区间,有必要对此进行精细定位,尽可能地把关键区间缩小,但精细定位难度很大。利用一般群体进行QTL定位时,QTL的可信区间通常在10 cM以上14,很难确定检测到的一个主效QTL到底是一个还是包含有多个微效QTL 15。因此,还须构建特殊的实验群体来精细定位QTL。目前设计了多种方法进行QTL的精

7、细定位,如高分辨率的杂交(high-resolution crosses,构建同类系(congenic strains,近等基因系(near-isogenic lines,NIL,后代测试(p rogeny testing,连锁不平衡(linkage disequilibrium ,LD分析,家系研究(family-b ased studies,或是病例-对照研究(case-control studies等5。实验一开始的低分辨率连锁分析主要用来发现QTL,以便进行接下来的精细定位研究,与其相反的是,高分辨率研究的目标是有效缩小侯选区间的范围。综合使用这些方法能把QTL的可信区间降到1cM 以

8、下16-19。研究QTL精细定位最好的群体是构建目标QTL的近等基因系(QTL-NIL。近等基因系的基本特征是整个染色体组的绝大部分区域完全相同,只在少数几个甚至一个区段存在彼此差异。因此,它能使基因组中只存在一个或几个QT L分离。这样做可以消除其她背景干扰和消去主效QTL对微效QTL效应的掩盖作用,从遗传上和统计上为QTL定位创造条件。尽管近等基因系构建时间长、工作量大,但近等基因系对QTL分解和精细定位的独特优越性使其成为分离和克隆QTL的理想群体。构建近等基因系,首先需要对QTL初步定位,再结合回交和分子标记辅助选择,对QTL靶区间进行正选择,对背景进行负选择,从而快速构建靶区间的近等

9、基因系。如果创建一套覆盖全基因组的染色体片段的替代系,将对QTL精细定位提供非常便利的条件。目前在番茄中已建立起这样的替代系20。DorweiIer等21利用近等基因系把控制玉米主穗差异的基因座TGA1,精确定位成孟德尔基因。Yamamoto等22用连续回交选育的方法获得水稻抽穗期近等基因系,其后代的抽穗期分离呈现一对基因的孟德尔遗传分离规律,6号染色体上的抽穗期主效QTL(Hd1定位在相距0.6 cM的R1679-P130之间,与C235共分离。Yano等23把一个12kb的基因组序列确定为该QTL的候选基因,并发现双亲的等位基因序列间存在多种差异,包括碱基替换、一段缺失和一段插入等。应用N

10、ILs和亚NILs(sub-NILs,精细定位了3个番茄迟发枯萎抗性QTL24。理论研究表明,缩小QTL可信区间的瓶颈在于研究群体只能提供有限的减数分裂的信息25, 26。因此,有学者建议应充分利用生物在长期繁育过程中累积起来的标记与QTL之间的重组信息。目前,常联合采用连锁与连锁不平衡进行QIL的精细定位27(二近交群体中QTL的精细定位能够方便构建近交群体的生物,如水稻28、玉米29、小麦30、果蝇31、酵母32等,使得一些数量性状得到了精细定位。本文着重介绍近交小鼠的精细定位。近交小鼠是研究复杂性状和人类疾病的很好的模型。一个近交系是由经过连续20代以上全同胞或亲子交配培育而成的品系,可

11、以认为在整个基因组上所有的遗传位点都是纯合的。只要品系间有差异,就可以利用品系间杂交2代、2代以上以及回交群体中性状分离的个体进行控制基因位点的确定。利用近交小鼠可构建许多精细定位所需的群体。1、以高级互交系(Advanced intercross line, AIL进行QTL的精细定位该策略是Darvasi在1995年提出的33。AIL是由两个近交系随机交配产生F1代,F1代个体再随机互交产生F2代。以同样的方式产生AIL F3、F4、F5,直到获得实验所需的A IL为止。为了增加染色体间重组的概率,在实验动物的繁殖中应避免同窝间的交配。AIL能进行QTL精细定位的理论基础是一个群体之间不断

12、的互交,能减少连锁不平衡,使得任何连锁位点之间重组的几率趋向于0.534。经过多代交配以后,精细定位所需的重组事件就会在AIL个体中积累,达到实验检出的水平。对AIL群体大小的要求是不少于100只。利用AIL寻找QTL时,因能打破QTL与连锁标记位点之间的连锁不平衡,所以可以把几个连锁的QTL与一个效应较大的QTL区别开。QTL定位的精度用可信区间来表示,与AIL定位精度有关的参数有染色体的长度,QTL所在区间相对于染色体末端的距离,标记之间的跨度,实验群体的大小,QTL效应的大小等33,这和用F2代小鼠定位参数是一致的35。一些在F2代中提高定位准确性的方法,如Zeng36提出的"

13、复合区间作图法"(CIM,在AI L中也同样适用。当在一个区间检测一个QTL时,CIM方法可利用其它标记作为协方差控制其它QTL,并且减少了残余方差,这样检测就有所改进,而且AIL能把连锁在一起的QTL 显着分开。F2代和回交(back cross,BC小鼠,也能进行QTL的精细定位,但须繁育大量的群体。比如,一个效应为25%的QTL,精细定位至5 cM,利用F2代需4500个个体,而用AIL (F10只需1500个个体33。若繁育个体和表型测定的成本低,或是一些简单的形态学性状,用F2进行精细定位也不失为一种方法。若表型很难测定,或对一些复杂的行为进行定位,采用AIL更好。两个近交

14、系杂交的后代经连续20代以上兄妹交配可形成重组近交系(Recombinant inbred line, RIL,此过程中染色体的重组概率也在不断增加,一个RIL积累的重组事件与AIL (F4的相同。使用AIL定位QTL的效率,和使用多个RIL是一致的,花费却只是培育一个RIL的费用。若某个性状是由少量低遗传度的QTL决定的话,那么使用RIL更有效,因为RIL更能降低环境因素的影响33。运用A/J×C57BL/6J(F6AIL,Iraqi等人成功精细定位了小鼠三个锥体虫抗性数量性状基因座37,38。Wang等人在C57BL/6J×NZB/BlNJ (F11群体精细定位了浓缩高

15、密度脂蛋白(HDL胆固醇的4个QTL39,分别位于1、5和16号染色体上。肺腺癌易感基因1-3 40在(A/J×C57BL/6 F(11 AIL中也得到了精细定位。2、选择性表型测定(Selective phenotyping虽然繁育了大量的F2与BC群体,但只有在原QTL所在区间发生染色体重组的个体才用作表型的测定。因为一旦某个QTL定位到某个区间内,那么只有在那个区间内发生重组的个体对精细定位才有意义。任何次数的重组都会缩小QTL所在的区间,随后在更小的区间内寻找新的重组。实验时,需要测定表型的动物总量会减少,减少量为F2代个体的1/2r(1-r,BC个体的1/r(r 为所研究Q

16、TL内发生重组的概率,但繁育的动物总数与F2和BC的个体数相同,所以这种方法不常用。3、利用带有特异片段的同源系(interval-specific congenic strains,ISCS进行精细定位若要对某区间进行精细定位,须使在该区段内发生染色体重组的个体与亲本反复回交,以减少亲本其它QTL对表型的影响。然后,这些个体再互交,选择具有重组单倍体的纯合子确立一个ISCS。杂交的每一步都需要用DNA标记来筛选实验所需的个体以减少繁育代数。利用ISCS,Ehringer等人精细定位了小鼠3个与酒精有关的QTL,称为Znf142, Ptprn和Z nf13341。作者还认为,对ISCS小鼠联合

17、使用高通量的序列比较和QTL的精细遗传图谱,可以加快从QTL到基因克隆的过程。4、重组后代检测(Recombinant progeny testing如果个体带有我们感兴趣的重组染色体片段,可以让它们与亲本杂交,把QTL所在的区间在个体中固定下来。为了把QTL所在的可信区间由ycM减小为xcM,就必须有y/x个重组个体,每个个体带有一个宽约y/x的重组区间,所有个体覆盖原ycM的范围。联合ISCS和重组后代检测,把小鼠对酒精和戊巴比妥的撤退依赖性的QTL精细定位至4号染色体小于1cM的区间内42,而在小鼠的体重QTL研究中,把X染色体上的区间缩小至2cM以内43。5、重组近交分离试验(Reco

18、mbinant inbred segregation test,RISTRIST是十分新颖的实验设计,充分利用了重组近交系(RI的高分辨率图谱,并成功运用到QTL的定位中。为了把QTL区间由ycM减小为xcM,须选择y/x个RI系,各系在ycM 内均发生重组,所有RI系的重组区段能覆盖y cM的区间。有时,实验实际所需的RI系数目比理论的要少,因为一个RI系在感兴趣的区间发生不止一次的重组。为了产生RIST群体,需P1和P2两个近交系,以P1,P2交配产生一个RI。选择一个在感兴趣区段发生重组的RI与P1、P2交配产生F1代,分别称为F1.1、F1.2,随后F1代互交,产生RIST-F2代,称

19、为F2.1、F2.2。RIST-BC是由P2×F1.1,产生BC1,P2×F1.2产生B C2。对于加性效应,趋向采用RIST-F2作为研究群体,因为在这种情况下,标记位点上同源基因型会提供更多的信息,并且只对标记位点纯合的个体进行表型测定。而当考虑显性效应时, RIST-BC会更有效。6、HS(heterogeneous stock与整个动物种群相比,近交系所产生群体的遗传异质性显着减小,那些在野生群中分离的Q TL在近交群体中有可能不分离。为了解决这个难题,Mott44等人构建了HS。这是由近交系C57BL, BALB/c, RIII, AKR, DBA/2, I, A

20、和C3H/2按8种方式交配,共形成40个交配对,它们的子代再随机互交,这样杂交60代,确保产生的每一代没有共同的祖父母。这样HS个体中的每一条染色体都是祖系(founder strains很好的遗传嵌合体,它们重组的平均距离是1/60 或1.7 cM。HS提供了在8个近交系中寻找任一分离QTL的可能性。通过H S,Mott验证了原发现的5个与恐惧有关的QTL。由于HS充分利用了多代交配积累下来的交叉重组,所以经过有限数目的连锁杂交以后,一个亲本的单倍型能够被缩小至很小的区段。该理论在小鼠QTL的精细定位中把可信区间缩小到1cM45,比F2代得到的分辨率要提高30倍33,46。HS研究也存在一些

21、弊端:遗传异质效应对QTL定位的干扰作用;缺乏遗传背景明确的品系进行随后的功能研究6;定位的敏感性太高,有可能把QTL标错47。利用HS群体,Volkman等人成功定位了决定小鼠股骨大小与形状的QTL48,Galsworthy 等定位了决定小鼠一般认知能力的QTL49。在研究酒精诱导的运动活动中,在D2Mit94 和D2Mit304之间,发现3个QTLs,它们的分辨率达到2 cM或更小50。7、以敲除(Knock out的方法作为同源系来研究QTL仅仅通过回交的方法是不能消除侧翼基因对所研究QTL的影响的。即使回交100代,也只能把QTL区间缩小至2cM51。2001年Bolivar52等利用

22、近交系129的基因敲除小鼠与C 57BL/6J(B6回交,产生了B6的遗传背景基础上带有129小片段染色体的小鼠。Bolivar比较了带有129小片段染色体的B6小鼠与该129片段被敲除的B6小鼠(B6.129-KO的表型差异,如果发现不同,就能把敲除片段的效应从侧翼基因的效应中区别出来。Jackson实验室已成功繁育了大量的B6.129-KO系小鼠供实验用,所以这项技术的应用前景十分广阔53。以敲除方法产生的同源系,虽然可靠,但仍不能减少对RI、F2或回交群体的需要。联合使用一些同源系分析方法,可能省略QTL初始定位的步骤,但有一些缺陷,比如和某个位点具有同向作用的QTL可能不易被发现,也会

23、降低上位效应以及相互作用的其她位点的信息。用B6.129-KO同源系可以定位新的QTL或确定已经存在的QTL,但不可能把定位的区间降到1-2 cM以下,因为同源系带有的片段本身就有10-20cM。但用这种方法可以加快129×B6精细定位和表型相近的QTL的定位。8、基因组标签小鼠基因组标签小鼠(genome-tagged mice, GTM是Iakoubova54等描述的。虽然同源系能进行QTL的精细定位,但培育同源系时须不断与亲本回交,然后在每一子代个体中筛选带有供体染色体片段的小鼠,比较费时。加快这一过程的方法是构建一个同源系库,在其它遗传背景基础上构建包含有某供体小鼠整个基因组

24、的同源系。通过标记辅助(marker-assis ted技术构建了两套重叠同源系,每套同源系包含有超过60个的小鼠品系。C57BL/6J 作为背景系,而DBA/2J 或CAST/Ei 作为供体系,由于选作背景系和供体系的小鼠在遗传和表型上差异大,所以用GTM可快速定位表型的遗传基础。在复杂行为中,如学习与记忆的QTL等已经在GTM中定位至8.8cM的区间内55。9、染色体替代系(chromosome substitution strains, CSSsCSS是通过不断回交的方法,培育仅有一条染色体和其她近交小鼠不同的近交系56。用来实验的两个亲本只是某条染色体的不同,其它染色体均相同9。Nad

25、eau报道构件建了带有A/J染色体片段的B6小鼠(B6.A,后来又陆续构建了A.B6,B6.129,和129.B6等CSS 小鼠。第一个CSSs被成功用来研究睾丸母细胞瘤遗传易感性的基因定位。因为CSSs有一个基本相同的遗传背景,所以和分离系相比,作者仅用少量的CSSs群体就得到了很强的连锁证据10。一旦CSSs被成功构建,不需要进一步的基因分型和杂交,就可以明确QTL是否存在在某条染色体上,而且不受其它分离QTL的影响。CSSs还可以用来繁育同源系(co ngenic strain,比传统的方法相比,可减少繁育的代数。用一个CSS与供体系(donor str ain交配来寻找剩余QTL,可以

26、消除固定QTL的混杂影响。若能获得两个亲本足够的CSS 嵌合体,则更容易区别和发现基因的相互作用。CSS也能进行QTL的功能研究。10、诱导突变利用化学诱变剂,如亚硝基乙基脲(ethylnitrosourea,ENU,可有效的诱导影响表型的单基因发生突变。ENU诱导的特定基因高频突变,通常的形式是A:T和G:C之间的颠换57,产生一系列具有表型效应的突变群体。以广谱致突变剂,如EMS 和ICR199等处理胚胎干细胞,可以增强诱导效果58,59。诱导突变时,影响复杂性状的每个基因都可能是潜在的被诱变对象。相同表型测试法可筛选突变的小鼠,若该方法具有在同源系中发现一个QTL 的敏感性,那么也能在诱

27、导突变系中检测影响该性状的突变基因。诱变实验成功的关键是要有一系列高效、可靠的表型测定来检测大量的突变小鼠,并且要设计随后的试验来确证该表型是被诱导的。诱导突变也有一些局限性:和QTL一样,一些突变也不容易被发现;由于遗传背景的影响,在连锁交配时一些突变也不易被发觉。由于诱导突变很容易鉴定表型变异的遗传基础,发现单基因突变引起的性状改变,在QTL研究中可以省略很多繁复的步骤,为寻找基因提供了一条简单的途径。在小鼠中进行精细定位,在大鼠中也同样适用。如利用同源系大鼠对NOD大鼠1型糖尿病的易感基因进行了定位60。在自发高血压大鼠(SHR中,通过cDNA点阵、同源性制图和放射杂交(radiatio

28、n hybrid ,RH,对胰岛素抗性基因进了精细定位61。有学者发现了同源系大鼠的数量基因座Mcs1内三个Copenhagen基因对乳腺癌的具有抗性作用62。(三远交群体QTL的精细定位在近交系中构建暂时性分离群体、永久性分离群体和近等基因系群体进行精细定位的方法,在实验生物中是可行的,但在人类和大部分家畜中是不切实际的。在这类群体中不仅可以进行非参数的连锁分析对复杂性状进行定位,而且还可充分利用群体在繁衍过程中积累的历史重组事件,即连锁不平衡和血缘一致性(identity-by-descent, IBD进行定位63。连锁分析适合家系资料的研究,属于低分辨率的研究,精度在10cM以内64。应

29、用连锁分析对复杂的疾病进行研究时,可能由于疾病的迟发、缺少足够的家系以及诊断不严格等因素,会严重影响研究的准确进行。由群体遗传学理论已知,在生物长期进化过程中,许多因子,如选择、迁移、基因突变和遗传漂变等,均可导致不同位点间的等位基因连锁不平衡的产生。当群体随机交配时,位点间的连锁程度会随世代交替而衰退,其衰减速率与位点间的重组率呈固定的对应关系。群体中连锁不平衡的长期保持标志着QTL与标记位点存在紧密的连锁关系。这样,通过测定一个标记位点与潜在的QTL之间的连锁不平衡程度即可断定QTL所在的位置。与连锁分析相比,连锁不平衡与关联分析所研究的群体中,带有相同的等位基因或单倍体的个体亲缘关系较远

30、,与典型的连锁分析所用个体相比,有着更多的减数分裂。因此,关联定位更精确。等位基因关联研究是一种非参数性方法,它对连锁分析所显示出的兴趣区域进行候选基因位点和细致基因定位评价非常有用处,所以目前广泛用来疾病基因的定位。对于常见的由高频率、低风险等位基因引起的疾病,采用疾病位点等位基因的关联分析比连锁分析更为有效6 5。等位基因关联是指疾病性状的标记等位基因发生率的显着性改变(增加或降低,它代表与疾病性状或表现型相关的等位基因在随机发生中的偏差66。等位基因关联研究起源于变异(多态性的直接生物学行为,或者源于相邻可疑基因连锁的失衡。连锁失衡常发生于二对共同遗传数代并在位置上非常靠近的等位基因,一

31、般的规则是连锁失衡越明显,标记基因距疾病基因位点越近,但这还要受标记等位基因人群频率和标记位点突变率的影响。特殊表现型的优势选择和随机遗传漂变,可使等位关联分析复杂化。传递不平衡测试(transmission disequilibrium test, TDT被用来检测遗传性状与标记之间的连锁与关联关系。当初TDT用来分析质量或数量性状时,需杂合亲本的非相关后代作为研究群体,现已扩大了其使用范围67,广泛用在等位基因关联研究中。有学者还专门研究了TDT在先天脊柱侧凸和等位基因aggrecan关联分析中的效率问题68。利用连锁不平衡理论,人类遗传学家已能把影响人类疾病的质量基因定位在小至1cM区域

32、内,有些基因已被克隆出来。Luo 69-71等人进一步发展统计分析方法检测及估算分子标记与QTL之间的连锁不平衡系数,从而提出了人类复杂遗传疾病高解析度基因定位的理论策略。以此为基础,胡中立等进一步探讨了供试群体在双亲基因频率存在差异时检测QTL 和检测QTL互作的方法,并给出了有关的理论结果72。有人发现连锁/连锁不平衡综合分析,效果比单纯连锁分析或LD分析更好, 尤其是在影响性状的基因比较多,QTL内有大量的突变和标记密度较低的时候更为适用73。Bayesian法就是联合运用了连锁/连锁不平衡综合分析,由于充分考虑了每个标记和每个子代的信息,所以不管有无LD信息,Bayesian法均可以精

33、确估计加性效应和显性效应74。由于第三代遗传标记SNPs数量多、分布广泛、相对稳定且易于筛查和基因分型,在群体遗传学得到广泛应用,丰富了对群体遗传学的认识,能更好了解基因型-表型的关系,极大提高了数量性状的精细定位能力。对小部分染色体区域的研究表明:不同遗传背景的SNPs可以引起相关群体不同标记的连锁不平衡的明显变化75。已经证实:LD不仅与物理图距有关,而且与标记所包含的信息有关。使用双等位SNP标记,可以把LD固定在0.1cM左右76。为了更有效地应用连锁不平衡进行关联研究,必须仔细选择具有相同病因起源的人群作为研究对象。总之,进行SNPs 关联分析应考虑以下几个方面:病例和对照人群起源相

34、同,各项指标应有很好的对应关系。连锁和关联分析结合分析。采用一个或很少的标记得到的阴性相关结果并不能排除其周围序列对疾病的风险性。与疾病相关的阳性标记未必能确定其周围的致病序列。应用致病等位基因与其周围SNPs的连锁不平衡性可提高关联分析的效果。理论上,如果某一SNP与其附近的致病等位基因呈现较强的连锁不平衡性,那么二者应该与疾病表现出相似的关联性。可应用一系列随机SNPs扫描其周围的DNA序列以发现指示起病效应的关联信号。由于基于连锁不平衡进行的关联分析采用的是一组随机的多态性标记,并依赖于致病位点本身及其邻近的标记具有足够的连锁不平衡性,所以这种方法在隔离人群中非常有效。因为隔离人群可能起

35、源于同一祖先,群体的建立时问和群体的大小都是确定的,隔离可以排除混杂群体因素。群体的建立时间可以提供与疾病相关基因突变形成的界限,而小群体也增加了疾病是由某一个体产生的可能性,从而增强了疾病与群体中一个特异单倍体的关联。但对于其她群体来说,由于连锁不平衡的不可预测性,基于连锁不平衡进行关联研究则比较困难77,78,这时可使用周围基因组中的SNPs进行连锁不平衡关联研究79。对具有纯合子型致病基因和固有连锁不平衡的疾病人群进行严格选择,同时还应考虑到单倍体之间的关系。有人对SNPs采用多点连锁不平衡定位(multipoint linkage-disequilibrium mapping,不但可以

36、缩小区间,还可以鉴定变异的异质性,选用SNPs的总量下降38%,而可信区间的范围缩小20%80。在一些迟发疾病的关联分析中,一些父母的基因型可能丢失。若没有父母的基因型,家系分析时可比较受累个体与不受累同胞对之间等位基因频率,或利用同胞来推测父母的基因型。统计软件TRANSMIT就是利用了后一种方法。通过对血源一致性参数的估计,对父母传递和受累同胞之间的相关性进行调整。模拟数据表明,这种方法的效率比子代的不平衡测试和家系关联分析的效率高,有人还用此方法对家族性Parkinson病的侯选基因进行了验证81。联合运用上述理论与方法,精细定位了控制牛奶成分的QTL。通过孙女设计(granddaugh

37、t er design,在含有1158个个体的牛群中,对BT6q11-16区间内9个微卫星标记和3个SNPs标记进行高密度遗传图谱的连锁和关联分析,精细定位了控制牛奶成分的QTL82-8 4,在这区间里的DGAT1基因可能是侯选基因85。人类的很多遗传病也得到了精细定位。在一些人群中证实了HLA-DQA与1型糖尿病关联关系86。通过对全基因组的扫描,在2号染色体上发现了一个与2型糖尿病强烈连锁的区间87。在寻找与其相互连锁的区间时,把该区间缩小至7cM。这个区间跨度只有1700kbp。在该区间运用多个SNPs的关联分析,发现2型糖尿病可能与calpain-10 (CAPN10有关8 8。中国北

38、方汉族人群2型糖尿病候选易感基因也取得了很大的进步。杜玮南等通过增加微卫星位点密度,扩大样本量,运用GeneScan和G enotyper程序获得位点信息,最后经参数和非参数连锁分析,对1号染色体上的中国北方汉族人群2型糖尿病易感基因进行了验证和精细定位89。并对其中的易感基因,蛋白激酶C亚型(PRKCZ内的单核昔酸多态性进行群体相关分析及连锁不平衡分析,表明PRKC Z基因内由5个SNP位点组成的单体型可能和中国北方汉族人2型糖尿病相关,进一步从统计学角度证实了PRKC Z基因为该人群疾病易感基因90。血浆中淀粉样蛋白(Abet92的水平,可以作为迟发阿尔采默病(LOAD的一个数量表型。有学

39、者先是在10号染色体上80cM处,发现了显着连锁关系,受累同胞对的研究也证实了这一结果。接下去的SNP连锁不平衡分析,表明VR22与LOAD有相关性91。(四候选基因法进行QTL的精细定位候选基因法也是精细定位QTL的一种有效方法。根据已知的生理、生化知识选择具有某种功能的基因(候选基因,通过分子生物学实验检测这些基因及其分子标记对特定数量性状的效应,然后筛选出对数量性状有影响的基因或标记,并估计出它们对数量性状的效应值。目前设计了很多侯选基因的关联分析法92。最简单的设计是流行病学的病例-对照研究,比较病例与对照组中等位基因的频率。疾病与可测危险因素的因果关系是其中的混杂因素。有两种方法可以

40、解决混杂因素的干扰:配对病例-对照研究,把对照个体与病例相配对,以消除潜在混杂因素如性别、年龄的影响,每对配对分别检查危险因素,观察侯选基因在病例组中出现的频率是否高于对照组。用亲属作为病例的对照。第一个设计的是非受累同胞作为对照。后来又设计了包括双亲的对照93,94。用候选基因法已成功地定位了一些基因,如猪的肥胖基因(Obesity、肌浆蛋白基因(Myogenin、雌激素受体基因(ESR、大肠杆菌k 88受体基因等95。虽然QTL的精细定位得到了快速的发展,但真正位置克隆的基因还不多。目前报道的还只有番茄果实重的主基因96,人类对苯硫脲尝味敏感基因等97。但是随着人类、小鼠等模式生物、水稻、

41、玉米等植物基因组计划的完成,必将推动QTL精细定位及位置克隆的巨大发展。参考文献1. 陈竺。医学遗传学。北京:人民卫生出版社,2001,83-87。2. Thoday JM. Location of polygenes. Nature,1961,191:368-370.3. Paterson, AH. Molecular dissection of quantitative traits: progress and prospects . Genome Res,1995,5:321-333.4.Darvasi A. Experimental strategies for the genetic

42、 dissection of complex traits in a nimal models. Nature Genet,1998,18:19-24.5. Glazier AM, Nadeau JH ,Aitman TJ. Finding Genes That Underlie Complex Traits. Science, 2002, 298: 2345-2349.6. Nadeau JH , Frankel WN. The roads from phenotypic variation to gene discovery: mutagenesis versus QTLs. Nature

43、 Genet, 2000,25:381-384.7. Cormier RT, Hong KH, Halberg RB, et al. Secretory phospholipase Pl27g2a confer s resistance to intestinal tumorigenesis. Nature Genet ,1997,17:88-91 .8. Fridman E, PlebanT, Zamir D. A recombination hotspot delimits a wildspecies qua ntitative trait locus for tomato sugar c

44、ontent to 484 bp within an invertase gene. Pr oc. Natl Acad Sci USA ,2000,97:4718-4723.9. Nadeau JH, Singer JB, Matin A , et al . Analysing complex genetic traits with chr omosome substitution strains. Nature Genet. 2000,24: 221-225.10. Matin A, Collin GB, Asada Y , et al . Susceptibility to testicu

45、lar germ-cell tumour s in a 129.MOLF-Chr 19 chromosome substitution strain. Nature Genet. 1999, 23: 2 37-240.11. Demant P , Hart AA. Recombinant congenic strains. a new tool for analyzing ge netic traits determined by more than one gene. Immunogenetics,1986,24:416-422.12. Legare ME , Bartlett FS, Fr

46、ankel WN. A major effect QTL determined by multiple genes in epileptic EL mice. Genome Res,2000, 10:42-48.13. Paterson AH. Molecular dissection of quantitative traits: progress and prospects. Genome Res, 1995, 5:321-333.14.Alpert KB, Tanksley SD . High-resolution mapping and isolation of a yeast art

47、ifici al chromosome contig containing fw2.2:A major fruit weight quantitative trait locus i n tomato. Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:15503-15507.15.Yano M,Sasaki T. Genetic and molecular dissection of quantitative traits in rice. P lant Molecular Bio,1997,35:145-153.16. Ikeda A. Microtubule-associat

48、ed protein 1A is a modifier of tubby hearing (moth 1. Nat Genet, 2002 ,30:401-405.17 .Frary A. A Quantitative Trait Locus Key to the Evolution of Tomato Fruit Size. S cience, 2000,289: 85-88.18. Gabriel SB, Schaffner SF, Nguyen H, et al. The structure of haplotype blocks inthe human genome. Science,

49、2002,21: 2225-2229.19.Takahashi Y, Shomura A, Sasaki T, et al. Hd6. a rice quantitative trait locus invo lve d in photoperiod sensitivity, encodes the subunit of protein kinase CK2. Science, 2001, 14: 7922-7927.20.Eshed Y, Zamir D. An introgression line population of lycepersicon pennellii in the cu

50、ltivated tomato enables the identification and fine mapping of yield-associated. G enetics, 1995, 141:1157-1162.21. Dorweiler J, Stec A, Kermicle J. Tesominte glume arcbitecture J.A genetic locus controlling a key step in maize evolution. Science, 1993, 262:233-235.22. Yamatomo T, Kuboki Y, Lin SY,

51、et al . Fine mapping of quantitative trait loci H d-1,Hd-2 and Hd-3,controlling heading date of rice, as single Mendelian factors. The or Appl. Genet, 1998, 97:37-44.23. Yano M, Katayose Y, Ashikari M, et al. Hd1, a major photoperiod sensitivity qua ntitative trait locus in rice, is closely related

52、to the arabidopsis flowering time gene CONSTANS. Plant Cell, 2000, 12: 2473-2484.24. Brouwer DJ, St Clair DA. Fine mapping of three quantitative trait loci for late bli ght resistance in tomato using near isogenic lines (NILs and sub-NILs. Theor Appl Genet, 2004, 108(4:628-638.25. Boehnke, M. Limits

53、 of resolution of genetic linkage studies: implications for the positional cloning of human disease genes. Am J Hum Genet,1994, 55: 379-390. 26. Guo SW, Lange K.Genetic mapping of complex traits: promises, problems, and p rospects. Theor Popul Biol,2000, 57:1-11.27.Meuwissen T, Karlsen A, Lien S, et

54、 al. Fine mapping of a quantitative trait locus for twinning rate using combined linkage and linkage disequilibrium mapping. Genet ics, 2002,161:373-379.28. Takeuchi Y, Lin SY, Sasaki T, et al. Fine linkage mapping enables dissection of closely linked quantitative trait loci for seed dormancy and he

55、ading in rice. Theor A ppl Genet,2003,107:1174-1180.29. Wu R, Lou XY, Ma CX, et al. An improved genetic model generates higher sol ution mapping of QTL for protein quality in maize endosperm. Proc Natl Acad Sci U SA,2002,99:11281-11286.30. Somers DJ, Fedak G, Savard M. Molecular mapping of novel gen

56、es controlling F usarium head blight resistance and deoxynivalenol accumulation in spring wheat. Ge nome,2003,46(4:555-564.31. Geiger-Thornsberry GL, Mackay TF. Quantitative trait loci affecting natural variati on in Drosophila longevity. Mech Ageing Dev,2004,125(3:179-89.32. Steinmetz L M, Sinha H,

57、 Richards DR, et al. Dissecting the architecture of a q uantitative trait locus in yeast. Nature, 2002, 416:326-330.33. Darvasi A., Soller M. Advanced Intercross Lines, an experimental population for fine genetic mapping. Genetics,1995,141:1199-1207.34. Falconer, DS. Introduction to quantitative gen

58、etics, Ed. 3. Longman, New York. 1989.35. Darvasi A, Weinreb A, Minke V,et al. Detecting marker-QTL linkage and estimati ng QTL gene effect and map location using a saturated genetic map. Genetics,1993,134:943-951.36. Zeng ZB. Precision mapping of quantitative trait loci. Genetics, 1994,136:1457-14 68.37. Iraqi F, Clapcott SJ, Kumari P, et al. Fine mapping of trypanosomiasis resistance loci in murine advanced intercross lines. Mamm Genome,2000,11(8:645-648.38. Iraqi F. Fine mapping of quantitative trait loci using