螺旋藻多糖对免疫低下小鼠淋巴细胞增殖及促进IFN-γ的诱生作用

1、螺旋藻多糖对免疫低下小鼠淋巴细胞增殖及促进IFN-的诱生作用         【摘要】  目的观察螺旋藻多糖对环磷酰胺所致的免疫低下小鼠淋巴细胞增殖作用和细胞因子IFN-的影响，探讨其对机体的免疫调节作用。 方法选择健康的雄性昆明种小鼠腹腔注射环磷酰胺制备免疫低下小鼠模型。采用MTT法检测细胞增殖；酶联免疫法测定脾细胞培养上清IFN-的浓度。 结果用药组小鼠脾细胞、胸腺细胞增殖OD值及小鼠脾细胞培养上清IFN-值与模型对照组相比均有显着性差异（P0.05或P0.01）。结论螺旋藻多糖能够促进小鼠淋巴细胞增

2、殖，并通过诱生IFN-而发挥免疫调节作用。 【关键词】  螺旋藻多糖 免疫低下 淋巴细胞增殖 -干扰素Abstract:ObjectiveTo observe the effect of Spirulina platensis polysaccharide on lymphocyte proliferation and IFN- induction in immunosuppressive model mice caused by cyclophosphamide. MethodsHealthy male Kunming mice were induced to establish

3、immunosuppressive model by the peritoneal injection of Cyclophosphamide. MTT colorimetry was used to examine the cell proliferation of spleen cell and thymus cell. IFN- concentration of cultural supernatant from spleen cell was determined by enzyme linked immunosorbent assay.ResultsCompared with the

4、 model group, the lymphocyte proliferation and IFN- production were increased significantly in PSP groups (P0.05,0.01).ConclusionPolysaccharide from Spirulina platensis has immune regulative effect by promoting the cell proliferation and IFN- induction.Key words:Polysaccharide from Spirulina platens

5、is;   immunosuppression;   Lymphocyte proliferation;   IFN-螺旋藻多糖(polysaccharide from Spirulina platensis, PSP)是从螺旋藻中提取的一种酸性、水溶性的杂多糖，除了具有丰富的营养价值外，还具有多种生物活性和免疫调节功能，如：抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗辐射等作用，已成为国内外药物研究开发的热点之一。本实验观察了PSP对免疫低下小鼠淋巴细胞的增殖情况及其对IFN-的诱生作用，为阐明PSP的免疫调节作用机制提供实验依据。1  器

6、材与方法1  材料1.1  螺旋藻多糖的提取 采用改良的三氯乙酸去蛋白法从螺旋藻中提取出的粗多糖，硫酸蒽酮法测定糖含量为90%以上。1.2   动物 昆明种小鼠（KM小鼠），雄性，68周龄，体重1822 g，由广东医学院实验动物中心提供。2  试剂与仪器 RPMI-1640培养基（美国GIBCO产品）；新生牛血清（杭州四季青生物工程研究所）；ConA（Sigma公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT, Sigma公司）；ELISA试剂盒（武汉博士德生物公司），其余试剂为国产分析纯。酶标仪：ELx8009（BIO-TEK公司

7、）。3  动物模型分组、制备及给药方法取健康昆明小鼠50只，随机分为5组：正常对照组(A组)、模型对照组(B组)和3组不同浓度螺旋藻多糖模型组(C，D，E组)，每组10只。A组每只小鼠腹腔注射生理盐水1 ml/d，连续10 d；B，C，D和E组每只小鼠先腹腔注射环磷酰胺2 mg/d，连续3 d，第4天开始分别注射生理盐水和不同浓度的螺旋藻多糖，连续7 d；观察免疫低下模型组小鼠与正常对照组小鼠比较，活动度降低、毛皮颜色较暗、无光泽等，表明造模成功。4   检测指标4.1  小鼠脾细胞和胸腺细胞悬液的制备无菌条件下拉颈处死小鼠，取出脾脏和胸腺，去脂肪和结缔

8、组织，分别放入盛有适量RPMI-1640培养液的培养皿内，剪碎置于培养皿中，用毛玻璃轻轻研磨，使细胞悬于RPMI-1640培养液中，然后用8层无菌纱布滤出单细胞悬液，然后用RPMI-1640培养液洗两次，将洗过的细胞悬液悬浮于含10%新生小牛血清的RPMI-1640完全培养液中，用0.4%台盼蓝染料计数细胞的活细胞率为95%以上。4.2  小鼠脾细胞和胸腺细胞增殖实验将细胞悬液接种于96孔培养板，脾细胞2×105/孔、胸腺细胞4×106/孔，然后每孔加入5 g/ml ConA 50 l，六复孔培养，于37，5%CO2培养箱中培养68 h后，加入5 g/ml MTT

9、10 l/孔，继续培养4 h，再加入三联液100 l/孔，混匀，放置过夜，次日用酶标仪检测各孔的吸光度OD570nm值。4.3   对脾细胞产生IFN-的影响将脾细胞悬液接种于24孔培养板，5×105/孔，在37，5%CO2培养箱中培养48 h，收集上清，冻存于-20。根据ELISA试剂盒方法说明操作，测定IFN-的含量。         5  统计学处理 用±s表示，应用SAS8.1统计软件进行单因素方差分析。2  结果2.1 

10、60; 螺旋藻多糖对环磷酰胺所致免疫低下小鼠脾细胞/胸腺细胞增殖反应的影响  结果见表1。表1  螺旋藻多糖对环磷酰胺所致免疫低下小鼠脾细胞/胸腺细胞增殖反应的影响(略)表1结果表明，与正常对照组相比，模型组小鼠的脾细胞增殖OD值显着降低（P0.01），胸腺细胞增殖OD值显着降低（P0.01），说明制备免疫低下模型成功。高、中、低剂量螺旋藻多糖可显着促进免疫低下小鼠脾细胞和胸腺细胞增殖（P0.05或0.01）。2.2   螺旋藻多糖对环磷酰胺所致免疫低下小鼠脾细胞产生细胞因子IFN-的影响  结果见表2。表2  螺旋藻多糖对

11、环磷酰胺所致免疫低下小鼠脾细胞产生IFN-的影响(略)表2结果表明，与模型组相比，高、中、低剂量螺旋藻多糖组均可促进免疫低下小鼠分泌 IFN-（P0.05或P0.01）3  讨论普遍认为多糖是一种免疫调节剂，具有无细胞毒性的特点，来源不同的多糖对机体的免疫功能具有不同程度的免疫调节作用，能够分别或同时激活T细胞、B细胞、NK细胞和巨噬细胞等免疫细胞，促进免疫细胞分泌细胞因子，增强机体的非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫，被认为是一种重要的生物效应调节剂。螺旋藻多糖是一种无毒性的水溶性酸性多糖，其分子量约为12 00016 000，是由多种单糖组成的杂多糖。小鼠腹腔注射螺旋藻多糖能明显增

12、加脾重，显着促进小鼠血清溶血素的形成和提高小鼠巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数1；螺旋藻由于其高浓度的营养成分使其具有多种生物活性和营养作用，具有生物调节和免疫调节的功能。不同的螺旋藻制剂能够影响免疫系统，如增加巨噬细胞的吞噬活性、刺激抗体和细胞因子的产生、提高组织中NK细胞的积聚、提高NK细胞的杀伤能力以及激活、活化T、B淋巴细胞2,3。Al-Batshan HA等4研究发现螺旋藻能够增强鸡的单核巨噬细胞功能，从而增强鸡的抗病能力。Hirahashi等5采用热水抽取法提取螺旋藻多糖，并研究发现其能增强NK细胞的杀伤能力。胸腺和脾脏是机体的重要免疫器官。一些免疫增强剂可以使胸腺和脾脏增重，而免疫抑制

13、剂则可使其萎缩。免疫器官细胞增殖分化受到抑制，就会使机体淋巴细胞总数降低，从而使机体免疫功能下降。环磷酰胺是较强的烷化剂，可杀伤各种免疫细胞，抑制各种动物的体液与细胞免疫应答6，使CD4+T细胞明显抑制，导致免疫抑制小鼠IFN-分泌降低。本实验结果表明，环磷酰胺能够明显抑制小鼠脾细胞和胸腺细胞的增殖和脾细胞分泌细胞因子IFN-，说明制备免疫低下模型成功。运用MTT法检测了正常对照组、模型组及螺旋藻多糖治疗各剂量组小鼠脾细胞和胸腺细胞的增殖情况，发现用螺旋藻多糖治疗各剂量组均能逆转由环磷酰胺引起的脾细胞和胸腺细胞增殖抑制，显着促进脾细胞和胸腺细胞增殖，说明 PSP能明显增强环磷酰胺处理的小鼠淋巴

14、细胞对ConA诱导的转化能力，从而提高了免疫细胞的免疫活性。IFN-是一种主要由Th1细胞分泌或旁分泌的细胞因子，可通过活化NK细胞和细胞毒性T细胞，发挥抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生物活性。PSP能够促进环磷酰胺处理的小鼠脾淋巴细胞IFN-的分泌，说明PSP可以通过调节细胞因子的分泌而影响机体的免疫功能。本实验研究结果表明螺旋藻多糖通过增强机体淋巴细胞增殖功能和影响细胞因子的分泌来调节机体免疫系统，有助于进一步说明PSP的免疫调节作用机制，对PSP进一步的开发利用提供了实验依据。【参考文献】  1左绍远,朱正宇,马涧泉.螺旋藻多糖( PSP) 对免疫功能的影响J.药物生物技术,199

15、6 ,3 (3) ：158.2Khan Z, Bhadouria P, Bisen PS. Nutritional and therapeutic potential of SpirulinaJ. Curr Pharm Biotechnol , 2005 ,6(5):373.3涂芳,杨 芳,郑文杰,等. 螺旋藻多糖的研究进展J.天然产物研究与开发, 2005,17(1):115.4Al-Batshan HA, Al-Mufarrej SI, Al-Homaidan AA, Qureshi MA. Enhancement of chicken macrophage phagocytic function and nitrite production by dietary Spirulina platensis. Immunopharmacol Immunotoxicol, 2001 ,23(2):281.5Hirahashi T, Matsumoto M, Hazek