连翘提取物对小鼠T淋巴细胞体外活化与增殖的影响

1、连翘提取物对小鼠T淋巴细胞体外活化与增殖的影响         11-01-31 15:49:00     编辑：studa20                  作者：尹乐乐, 曾耀英*, 黄秀艳, 侯会娜【摘要】  目的: 分析连翘(FS)提取物对小鼠淋巴结T细胞的体外活化与增殖的影响, 初步探

2、讨其免疫抑制作用机制。方法: 无菌分离小鼠淋巴结细胞, 加入多克隆刺激剂刀豆蛋白A(ConA)进行刺激, 利用荧光标记的单克隆抗体(mAb)染色结合流式细胞术(FCM), 检测小鼠T淋巴细胞的表达的活化抗原CD69、 CD25、 CD71的表达情况; 以羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯（CFDASE）染色, 以FCM分析FS对淋巴细胞体外增殖的影响。结果: 终浓度为40、 80、 160 mg/L的FS均对ConA刺激诱导的T细胞CD69、 CD25和CD71的表达有降低作用(P<0.05)。CFDASE染色分析显示, 上述浓度的FS对ConA诱导的小鼠T淋巴细胞增殖具有抑制作用(P<

3、;0.05)。结论: FS对ConA诱导的T细胞早、 中、 后期活化和体外增殖有抑制作用。 【关键词】  连翘提取物 T 淋巴细胞 活化 增殖Abstract  AIM: To investigate the effect of Forsythia suspensa (FS) extract on the activation and proliferation of the mouse T lymphocytes in vitro as well as its immunosuppressive effect. METHODS: The lymphocytes were

4、isolated from the lymphoid nodes of BALB/c mice. Fluorescence conjugated monoclonal antibodies and flow cytometry were used to detect the expression of CD69, CD25 and CD 71 of the activated T lymphocytes in vitro in response to Concanavalin A (ConA). Stained with CFDASE, the mouse lymphocytes were s

5、timulated by ConA. The effect of FS extract on cell proliferation in vitro was analyzed by flow cytometry. RESULTS: FS extract decreased the expression of CD69, CD25 and CD71 at the final concentration of 40, 80 and 160 mg/L, respectively（P<0.05）. CFDASE staining showed that FS extract at differe

6、nt concentration significantly inhibited the proliferation of lymphocytes induced by ConA (P<0.05). CONCLUSION: FS extract can inhibit the activation and proliferation of T lymphocytes in response to ConA. KeywordsForsythia suspensa extract; T lymphocytes; activation; proliferation连翘(Forsythia su

7、spensa, FS )又名旱莲子、 大翘子、 落翘等, 为木犀科植物连翘的果实。它作为传统中药广泛应用于对炎症、    发热和溃疡等方面的治疗1。同时, FS的主要活性成分连翘苷在抗氧化、 抗菌、 抗病毒和解热抗炎等方面2也起着重要的作用。两者在药理作用上的一致表现均可提示FS对机体免疫系统可能具有一定的调节作用。本研究中采用流式细胞术(FCM)检测了FS对刀豆蛋白A(ConA)刺激的小鼠T细胞体外活化和增殖影响, 研究其免疫学效应并初步探讨其免疫作用机制。1  材料和方法1.1  材料  清洁级BALB/c近交系小鼠(雄性, 81

8、0周龄, 体质量1822 g), 购自广东省实验动物中心。FS购自四川广汗市维康植化有限公司, 为木犀植物连翘的干燥果实提取而成, 按干燥品计算含连翘苷不得少于0.15%。FS临用前用RPMI1640液稀释至所需浓度。L谷氨酰胺、 巯基乙醇、 刀豆蛋白A(ConA)购自Sigma公司。PE抗CD3单克隆抗体(mAb）、  FITC抗CD69 mAb、 PE抗CD25 mAb和PE抗CD71 mAb购自PharMingen公司。羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFDASE)购自美国Molecular

9、Probes公司。RPMI1640培养基、 胎牛血清(FBS)为美国GibcoBRL公司产品。流式细胞仪(FACS Calibur)为美国Becton Dickinson公司产品。1.2  方法1.2.1  淋巴细胞悬液的制备  断颈处死BALB/c小鼠, 无菌分离小鼠双侧颌下、 锁骨下、 腋窝、 腹股沟和肠系膜淋巴结, 去掉被膜, 于200目金属网上研磨过滤, 收集细胞, 冷PBS洗涤2次（250 g, 5 min）。用RPMI1640完全培养液(含100 mL/L的FBS)重悬, 调整细胞密度为1×109/L, 质量分数为2 g/L台盼蓝染色判断活细

10、胞百分率达97%。1.2.2  淋巴细胞培养  将细胞密度为1×109/L淋巴细胞悬液接种于96孔板, 分别加入不同浓度的FS(终浓度为160、 80、 40 mg/L）, 每孔终体积为200 L, 然后在37、 50 mL/L CO2培养箱中预孵育4 h后加入ConA(终浓度为5 mg/L), 置于37、 50 mL/L CO2培养箱继续培养48 h。1.2.3  CD69、 CD25和CD71表达情况检测  采用直接免疫荧光标记法染色。设5个实验组: 对照组（未加ConA和药物刺激）, ConA组, (ConA+FS 40mg/L), (C

11、onA+FS 80mg/L), (ConA+FS 160 mg/L), 且每组均设6个复孔。分别于细胞培养6、 24、 48 h后取出各孔细胞悬液离心浓缩后, 对应上述时间点分别加入PE抗CD3 mAb和FITC抗CD69 mAb(6 h 检测)或PE抗CD25 mAb(24 h检测)或PE抗CD71 mAb (48 h检测) 1 g/106细胞, 混匀后, 4避光作用30 min, PBS洗涤细胞2次(250 g, 5 min), 300 L PBS重悬细胞,   进行FCM检测。1.2.4  T淋巴细胞增殖CFDASE染色检测  得到的淋巴细胞重悬于

12、PBS中, 按参考文献3进行CFDASE染色。CFDASE用二甲基亚砜(DMSO)溶解成10 mmol/L的储存液, -20 保存。临用前, 取适量用PBS稀释成1 mmol/L的工作液, 备用。PBS调整淋巴细胞悬液密度为1×1010/L, 加入CFDASE工作液(终浓度为1 mol/L), 充分混匀后在37条件下轻轻振荡10 min。然后用RPMI1640培养液洗涤2次(250 g, 5 min), 计数, 重悬于RPMI1640完全培养基中, 并调整细胞密度为1×109/L, 接种于96孔板。设与上述相同的5个实验组, 每组6个复孔, 置于37、 50 mL/L CO

13、2培养箱继续培养, 于48 h收获培养的细胞, 用PBS洗涤细胞2次, 离心浓缩后按每1×106细胞加入1 g PE抗 CD3 mAb, 混匀后室温下避光放置30 min, PBS洗涤细胞2次, 300 L PBS重悬细胞, FCM检测。1.2.5  FCM检测及分析  所有样品经FACSCalibur流式细胞仪和CELLQuest软件获取。先在前散射(FSC)对侧散射(SSC)二维散点图中, 划出淋巴细胞区R1, 在横坐标为PE抗CD3 mAb, 纵坐标为SSC的图中, 划出CD3+细胞区R2, 然后对淋巴细胞上的CD69FITC等mAb及CFDASE的荧光强度

14、进行检测。其中CFDASE、 FITC为荧光1(FL1), PE为荧光2(FL2)。每管细胞悬液样品检测10000个细胞, 获得的数据用CELLQuest进行分析。1.2.6  统计学处理  统计分析用统计软件包SPSS10.0进行处理, 数据以x±s表示, 多组间比较采用方差分析, 两两间比较用LSDt检验。2  结果2.1  FS对CD69、 CD25和CD71表达情况的影响  小鼠淋巴结T细胞在静息状态下很少表达CD69、 CD25和CD71。单纯FS对其表达无任何上调作用。单纯ConA刺激活化6 h, ConA组的CD69表达

15、明显增加, 其百分率上升到(63.05±0.76)%。T细胞在单纯ConA诱导活化至24 h时, 组中的CD25百分率上调至(63.22±0.55)%。培养至48 h, 发现ConA组T细胞表面CD71表达百分率为(89.06±0.19)%。不同终浓度的FS加药各组均可降低ConA介导的上述标记的分子表达 (P<0.05）。其中, 160 mg/L的FS的抑制率最强, 它影响表达的各标记分子比率分别检测为CD69(38.85±0.33)%、 CD25(41.80±1.23)%和CD71(71.30±0.89)%, 与ConA组相

16、比较有统计学意义(P<0.01, 表1）。T细胞早期活化表达CD69的一次代表性实验结果见图1。表1  FS对ConA激活的T细胞表达CD69、 CD25及CD71的影响（略）Tab 1  Influence of FS  on the expression percentage of CD69, CD25 and CD71 on activated T cells in response to ConA stimulusbP<0.01 vs ConA group.图1  ConA激活的T细胞CD69的表达（略）Fig 1  The expression percentage of CD69 on activated T cells in response to ConA stimulus2.2  FS