氯化镧对大鼠生长素分泌调节影响的体外研究

1、    氯化镧对大鼠生长素分泌调节影响的体外研究*        摘要目的：研究氯化镧(LaCl3)对大鼠生长素分泌调节轴的影响。方法：采用荧光法检测离体脑片培育液中单胺类神经递质含量；用放射免疫法测垂体脑片育液中生长素(GH)含量。结果：0.01 mmol/L LaCl3垂体组育液中GH含量明显高于对照组(P0.05)；而1 mmol/L LaCl3垂体组育液中GH含量明显低于对照组(P0.05)。0.01 mmol/L LaCl3下丘脑+垂体组，其育液中GH含量则明显高于

2、对照组(P0.01)和同剂量的单纯垂体组(P0.01)；但1 ?mmol/L下丘脑+垂体组育液中GH含量与对照组比较无显著差异(P0.05)。0.01 mmol/L LaCl3下丘脑组育液中NE含量明显高于对照组(P0.01)，5-HT明显低于对照组(P0.05)。1 mmol/L下丘脑组育液中NE和DA含量明显少于对照组(P0.01和0.05)，而5-HT含量则明显高于对照组(P0.001)。结论：低剂量氯化镧可通过下丘脑和腺垂体双重作用促进GH分泌。主题词促生长素；生物源单胺类；脑 Study of effects of LaCl3 on regulatory axis of growth

3、 hormone secretion in vitroZHU Shi-Gong1, DUAN Ya-Qing2, GUO Zhong-Yu1, HUANG Min3, WANG Shao31 Department of Pathophysilogy, 2 Department of Forensic Medicine, 3 Department of Physiology,Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun (130021)Abstract AIM:To investigate the effects of Lant

4、hanum chloride (LaCl3) on regulatory axis of growth hormone (GH) secretion.METHODS：Measuring GH contents in pituitary slices cultured with radioimmunoassay, and measuring monoamine neurotransmitter contents in hypothalamic slice cultured with florescence analysis.RESULTS：GH content in pituitary slic

5、e culture was higher in 0.01 mmol/L LaCl3 group and was lower in 1 mmol/L group than that of the control group (P0.01). The GH contents in pituitary and hypothalamic slice culture was higher in 0.01 mmol/L LaCl3 than that of control group or the single pituitary group (P0.01), but there was no obvio

6、us changes in 1 mmol/L LaCl3 group compared with control group (P0.01). In hypothalamic culture, NE content was higher and 5-HT content was lower in 0.01 mmol/L LaCl3 and was lower than that of control group. In 1 mmol/L LaCl3 group, NE content was lower, 5-HT was higher than that of control. CONCLU

7、SION：Lower LaCl3 dose can act on both hypothalamus and hypophysis and elevated the GH level in culture directly and indirectly.MeSHSomatotropin; Biogenic monoamines; Brain研究稀土氯化镧(LaCl3)对生长素分泌影响的前期工作表明，一定量LaCl3注入大鼠侧脑室，下丘脑腹内核(ventromedial nuclei, VMN)神经元放电频率增加，下丘脑和血清中生长抑素(somatostatin, SS)含量下降，伴有血清生长素

8、含量明显增高；进一步研究表明，将微量LaCl3直接注入VMN，也可引起血清GH水平升高；直接注入引起VMN细胞放电增强；通过微电泳技术将微量LaCl3泳入VMN可使其神经放电频率增强14。说明脑内给予LaCl3可通过影响下丘脑功能活动来调节血清生长素水平，此外其在脑内是否还对腺垂体具有直接促进作用，或是对下丘脑-腺垂体-生长素轴各部位均有影响，生长素分泌调节有关的中枢神经递质变化如何均需深入研究。本研究采用离体脑片技术分别观察LaCl3下丘脑、垂体影响，分析LaCl3对生长素调节轴路的作用部位和机制。材料与方法一、主要仪器和试剂：(一)主要仪器：恒温振荡水浴箱(江苏常州国华仪器厂)，MCI-1

9、75型CO2培养箱(日本Sanyo公司)；Gamma计数仪(瑞士KONTRON公司)，F-3000荧光分光光度计(日本HITACH公司)。(二)主要试剂：人工脑脊液(aCSF):参照Blanton等的方法配制7，浓度(mmol/L)为NaCl 124、KC1 5、MgSO4 2、CaCl2 2、NaHCO3 26、NaH2PO4 1.25、Dextrose 10, pH 7.4; 氯化镧(中国科学院长春应用化学研究所制备)0.25 mol/L；去甲肾上腺素(NE)标准液；多巴胺(DA)标准液；5-羟色胺(5-HT)标准液；生长素放免试剂盒(天津生物工程有限公司)。生长抑素放免试剂盒(北京科锐生

10、物技术公司)。二、脑片制备及实验分组：Wistar大鼠15只，体重230250 g，用断头器迅速断头取出脑和垂体。在预冷人工脑脊液(aCSF)中，将含下丘脑的组织用振动切片机切成400 m厚脑片(34片/脑)。置脑片37人工脑脊液中，通以95%O2和5%CO2混合气，进行复苏1 h(同法处理垂体切片)，然后用于实验。将复苏好的脑片和垂体片置24孔板内，每孔24片(培育液0.25 mL/片)，每组5孔，在CO2培养箱中进行。实验分为三部分：第一部分为单纯下丘脑脑片培育实验，用含不同浓度LaCl3培育液培育下丘脑脑片1 h，收集各孔培育液，分为两份，一份用于单胺类神经递质含量测定，另一份用于培育垂

11、体。第二部分为单纯垂体脑片培育实验，分3组：人工脑脊液(aCSF)+垂体脑片(对照组)；含1 mmol/L LaCl3aCSF+垂体脑片；含0.01 mmol/L LaCl3aCSF+垂体脑片，培育时间为1 h，各组培育液用于生长素含量测定。第三部分为用下丘脑育液培育垂体实验(下丘脑+垂体)，分3组：(1)为对照组，aCSF培育下丘脑脑片1 h后，其育液再培育垂体脑片1 h，并测定后者中GH含量；(2)下丘脑脑片育液中含有1 mmol/L；其余同第(1)组；(3)下丘脑脑片育液中含有0.01 mmol/L LaCl3，其余同第(1)组。三、生长素和单胺测定：垂体脑片培育液中生长素(growth

12、 hormone， GH)按放射免疫试剂盒说明书进行测定。下丘脑脑片育液中去甲肾上腺素(norepinephrine, NE);多巴胺(dopamine, DA)和5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)含量采用荧光法测定8。四、统计处理：数据用±s表示,采用ANOVA和t检验对数据进行统计学处理。结果一、垂体脑片育液中GH含量变化：从表1可见，0.01 mmol/L LaCl3培育垂体组，其育液中GH含量明显高于对照组(P0.05)；而1 mmol/L LaCl3培育垂体组，其育液中GH含量明显低于对照组(P0.05)；aCSF培育下丘脑后再培育垂体组，其垂

13、体育液中GH含量与单纯aCSF培育垂体组无明显差异。0.01 mmol/L LaCl3培育下丘脑+垂体组，其育液中GH含量则明显高于aCSF对照组(P0.01)，也明显高于1 mmol/L LaCl3培育下丘脑+垂体组(P0.01)，还明显高于同剂量的单纯培育垂体组(P0.01)，见表1。表1含LaCl3人工脑脊液培育垂体育液中GH含量Tab 1 Content of GH in aCSF with LaCl3 and hypophysis slices (±s)Content of GH(ng/mL)HypophysisHypothalamus±hypophysisACS

14、F0.571±0.0800.620±0.088?1 mmol/L LaCl30.414±0.065*0.545±0.101?0.01 mmol/L LaCl30.705±0.059*#0.860±0.089*#*P0.05, *P0.01, vs ACSF group#P0.01, vs 1 mmol/L LaCl3 groupP0.05, P0.01, vs hypophysis group二、下丘脑脑片育液中单胺类神经递质含量变化：从表2可知，0.01 mmol/L LaCl3培育下丘脑脑片，其育液中NE含量明显高于单纯 aCSF

15、对照组(P0.01)，5-HT明显低于对照组(P0.05)，DA含量无明显变化。相反，用1 mmol/L LaCl3培育下丘脑脑片组，其育液中NE和DA含量明显少于对照组(P0.01和0.05)，5-HT含量则明显高于对照组(P0.01)。 表2下丘脑脑片育液中单胺类神经递质含量Tab 2 Content of monoamine neurotransmitter in clulture of hypothalamus slices (±s)Content of monoamine neurotransmitters (nmol/mL)NEDA5-HTACSF31.030±

16、3.61226.650±2.18512.430±1.4471 mmol/L LaCl322.520±3.448*21.990±2.313*17.220±2.087*0.01 mmol/L LaCl340.520±4.464*#23.780±2.6249.430±1.413*#*P0.05, *P0.01, vs ACSF group;#P0.01, vs 1 mmol/L LaCl3 group 讨论关于稀土化合物对生长素分泌的影响报道甚少，根据本室和其它学者的研究已知，低剂量稀土氯化物注入大鼠脑室、下丘脑或腹腔均

17、可促进GH分泌16。由于生长素的分泌受下丘脑-腺垂体-生长素轴调控，并受多种因素影响9，因此 LaCl3在体内影响GH分泌的作用部位值得深入研究。从实验结果可知，较高剂量 LaCl3(1 mmol/L)直接与垂体脑片培育，可抑制后者分泌GH，但此剂量 LaCl3先培育下丘脑，然后培育垂体，后者育液中GH含量与对照组比较无明显差异，提示下丘脑在 LaCl3作用下产生了某种促垂体GH分泌因素，并可削减了同量LaCl3直接培育垂体的抑制作用。而较低剂量LaCl3(0.01 mmol/L)直接培育垂体或培育下丘脑后再培育垂本，其育液中GH含量均明显高于对照组，而且后者增高更明显。说明低剂量LaCl3不

18、但可促进垂体GH分泌，而且还可通过下丘脑的促垂体因素加强垂体分泌GH，因此小剂量LaCl3在体内促进GH分泌作用应是对下丘脑和垂体二者综合作用的结果。已知下丘脑中调节垂体GH分泌主要因素是生长素释放激素(growth hormone releasing hormone, GHRH)和生长抑素(somatostatin, SS)，同时受很多神经递质的影响，其中了解较多的是单胺类神经递质，较为一致的观点认为NE可促进GH分泌，而DA和5-HT的作用尚不确定，多数观点倾向它们有促进作用，但也有不少抑制作用的报道，而5-HT和DA对GH双重影响可能是同一递质既可作用于GHRH神经元，又可作用于SS神经

19、元有关9。根据前期工作已知，低剂量LaCl3注入大鼠侧脑室可抑制下丘脑释放SS，这是LaCl3影响下丘脑调节生长素的重要因素之一，但不是唯一因素。检测下丘脑育液中单胺类神经递质变化表明，低剂量LaCl3培育下丘脑后，其浴液中NE含量明显增加，5-HT明显减少，DA含量变化不明显。这可解释为何用此下丘脑育液培育垂体，后者中GH含量明显高于单纯培育垂体组。高剂量LaCl3培育下丘脑组，其育液中NE和DA含量明显少于对照组，但5-HT含量则明显高于对照组。用此下丘脑育液培育垂体，后者中GH含量虽与对照组比较无明显差异，但却明显高于同量LaCl3直接培育垂体组，其5-HT含量增多，可能是GH含量不明显少于对照组的重要原因，支持5-HT是GH分泌的促进因素的观点。根据上述实验结果作者认为，较高剂量LaCl3对下丘脑-腺垂体-生长素分泌轴的综合作用以抑制为主，而低剂量LaCl3注入脑内对下丘脑-腺垂体-生长素分泌调节轴主要环节均有促进作用，即可促进腺垂体分泌GH；又可通过刺激下丘脑单胺类神经递质变化来加强GH分泌。* 国家自然科学基金攀登计划项目(39692008)作者单位:祝世功郭中钰:白求恩医学大学； 段亚清:病理生理教研室，法医教研室，黄民王绍：生理教研室(长春 130