癌症患者外周血淋巴细胞银染核仁形成区变化规律研究

1、癌症患者外周血淋巴细胞银染核仁形成区变化规律研究【摘要】目的用核仁银染强度探讨肿瘤患者外周血Th淋巴细胞rDNA转录活性与机体免疫状况的关系。方法应用计算机像分析系统，对癌症、炎症、非癌非炎性疾病患者及正常人外周血Th(CD4+)淋巴细胞中的核仁银染强度进行比较。结果与炎症、非癌非炎症疾病患者及正常人相比，癌症患者Th淋巴细胞核仁银染强度显著下降。结论癌症患者淋巴细胞rDNA转录活性可以灵敏地反映体内癌变进展程度与机体免疫状况的相互关系，有可能为临床诊断癌症提供一个简便可行的辅助方法。【主题词】淋巴细胞；核仁形成区；像分析；rDNA转录 Research on the regular patt

2、ern of Ag-NOR changes in patients with cancerCHEN Liqi, WAN Yuanlian, DING Lihua, et al.（Beijing Medical University, Beijing 100083, China）【Abstract】ObjectiveTo correlate the relationship between rDNA transcriptional activity of CD4+ helper T cells and immunity in patients with cancer through silver

3、 stainability of nucleolus organizing regions (Ag-NORs).MethodsThe Th(CD4+) rDNA transcriptional activity was compared among patients with cancer, infectious diseases, non-cancerous non-infectious diseases through image analysis.ResultsTh(CD4+) rDNA transcriptional activity was decreased extremely i

4、n patients with cancer, but increased in patients with inflammation compared with normal controls.ConclusionThe analysis of Th(CD4+) rDNA transcriptional activity may serve as a new tumor marker for tumor diagnosis and differential diagnosis. Therefore, it may provide an innovative and reliable meth

5、od for clinical cancer diagnosis.【Subject words】Lymphocyte;Nucleolus organizing regions;Image analysis;rDNA transcription我们应用像分析系统对不同疾病患者外周血淋巴间期Th细胞核仁银染强度进行了研究，旨在探讨体内癌变进展状况对外周血淋巴细胞rDNA转录活性的影响，为癌症的临床诊治提供一个辅助判断的途径。材料与方法1.研究对象：本研究为多中心合作课题，包括诊断明确的癌症、炎症、非癌非炎症患者及正常人。研究对象分别来自中国医学科学院北京协和医院、北京医科大学第一临床医院、第三临床

6、医院、中国人民解放军第三七医院、第一军医大学南方医院、哈尔滨医科大学第二临床医院。癌症组360例，炎症组204例，非癌非炎组149例，健康对照组110例。其中癌症组包括肺癌55例，结直肠癌93例，白血病15例，胃癌55例，乳腺癌64例，胰头癌12例，肝癌31例，绒癌27例，垂体癌2例，贲门癌1例，皮肤癌3例，脊髓癌2例。此外，尚对72例癌症患者进行了围手术期的检测。2.血样采集、培养及制片：空腹采集受试者外周静脉血0.5 ml，培养于RPMI 1640培养液中，37 72 h，同时用T细胞激活剂PHA促使G0期淋巴细胞进入分裂期。按Paul等1的方法，首先用抗CD4+抗体分别对每个血样之中的T

7、h淋巴细胞进行免疫组化标记，然后再用硝酸银对制片进行复染。3.检测：使用西德Kontron公司IBAS +型像分析系统和国产KL型肿瘤病理像诊断系统，于高倍镜下测量每片中10个Th细胞的核仁银染强度相对值。按以下数学模式计算：银染核仁面积/细胞核面积=1/mna/b公式中m为每组制片数；n为每张制片上被观测细胞数；a为每个细胞中银染核仁总面积；b为每个细胞核的面积。4.统计学方法：数据用均数标准差表示，采用方差分析和t检验。结果1.癌症、炎症、非癌非炎性疾病淋巴细胞核仁银染面积及积分光密度值的比较：癌症患者的淋巴细胞银染强度均明显低于5.0%，其中乳腺癌为5.5%，白血病4.0%，肝癌4.1%

8、，结肠癌4.7%，胃癌3.8%，直肠癌4.5%，肺癌4.2%。但正常人细胞核仁银染面积的相对值均8.0%，差异有极显著性（P0.01）。而各癌症组、正常人组之间差异无显著性。炎症患者Th淋巴细胞核仁银染强度均高于癌症组，核仁银染强度的相对值均高达10.6%，与癌症患者及正常对照组相比，差异有极显著性（P0.01）。非癌非炎性疾病组Th淋巴细胞的核仁银染强度也都明显高于癌症组，达到8.1%。2.癌症患者手术前后淋巴细胞核仁银染面积及积分光密度值的比较：患者Th淋巴细胞rDNA转录活性于手术后13个月上升，从4.0%左右上升到5.7%以上。讨论癌细胞具有与正常细胞不同的抗原性，可被免疫系统识别，并

9、引起体内相应的免疫应答。淋巴细胞除可作为免疫活性细胞直接参予机体抗癌反应外，还因为Th(CD4+)具有与巨噬细胞等抗原递呈细胞相应的组织相容抗原复合物（MHC-）受体，可识别由巨噬细胞递呈的、已经加工处理的抗原MHC-抗原复合体，从而引发Th细胞产生出大量的IL-2、IL-3、干扰素等淋巴因子，导致全身性免疫反应，包括由T细胞介导的细胞免疫过程，如NK对癌细胞的打击、Tc(CD8+)杀伤细胞向癌灶浸润和杀伤癌细胞等过程，以及多种由B细胞介导的体液免疫作用2-5。由此可见，Th淋巴细胞表面所表达的CD4+分子在增强和辅助T、B、巨噬细胞等参与的抗肿瘤免疫应答及分泌IL-等淋巴因子、增强Tc(CD

10、8+)杀伤功能等方面起着极为重要的作用。然而，随着癌症的进展，某些破坏机体免疫能力的因素在体内发挥了越来越大的作用，如癌细胞不断产生的一些肿瘤抑制因子、1-胎儿蛋白(AFP)、免疫抑制酸性蛋白(IAP)等，可使机体逐渐陷入免疫机能低下状态，造成Th淋巴细胞的生物活性下降，破坏原来的免疫平衡。因此，Th细胞生物活性的高低可直接反映出体内癌变的进展程度与免疫状况的相互关系6。自80年代以来，已公认细胞核仁形成区的银染面积及积分光密度可反映该细胞中rDNA转录活性及蛋白质合成水平7。1990年我们运用计算机像分析技术，证明间期淋巴细胞核仁的银染面积和银染积分光密度是检测淋巴细胞rDNA转录活性的较好

11、指标8,9。本研究发现，正常人细胞核仁银染面积的相对值均8%，而各组癌症患者大多5%，明显低于对照组。各癌症组间差异无显著性。癌症患者与炎症和非癌非炎疾病的比较发现，炎症患者Th淋巴细胞核仁银染强度高于癌症组及正常人组，相对值均高于9%。此结果与炎症患者白细胞数目增加相吻合。为探讨手术对免疫的影响及手术效果，我们对部分术后肿瘤患者进行了追踪检测，发现多数患者在术后13个月间Th淋巴细胞rDNA转录活性有所上升，从4.0%左右上升到5.7%以上，说明患者体内的免疫水平有所恢复。综上所述，我们认为以外周血淋巴细胞银染强度能反映癌症患者机体免疫水平的变化趋势，这一检测没有任何外界因素诱导，是直接由人

12、体血液得到的信号，因此它更能真实地反映出癌变过程中与代谢有关的血液功能变化，是一个简便、灵敏的肿瘤辅助诊断方法，尤其适用于肿瘤普查，并有利于进行追踪复查。陈立奇（100083 北京医科大学基础医学院）万远廉（北京医科大学第一临床医院外科）丁丽华（北京医科大学第三临床医院职业病中心）林其燧（中国医学科学院协和医院检验科）刘广贤（解放军第三七医院低温肿瘤研究室）李金翰（第一军医大学南方医院肿瘤科）陈家薇（哈尔滨医科大学第二临床医院病理科）陈克能（北京市肿瘤医院）参考文献1，Paul GM, David AR, Boldy R. Sequential demonstration of antigen

13、s and AgNORs in frozen and paraffin sections, J Pathol, 1989,159:167-172.2，Chen LP, Peter S, Crocker J, eds. Costimulation of T cells for tumor immunity. London: Elsevier Science Publishers Ltd, 1993. 54-56.3，侯建民，陈克能，王社民，等. 全麻下经胸食道癌切除前后外周血TNF、T淋巴细胞及其亚群变化. 中国麻醉学杂志，1998，18：283-285.4，程邦昌，陈克能，梅强，等.食道癌切除前后机体免疫功能的变化. 中华实验外科杂志，1998，15：83-85.5，梅强，陈克能，师晓天，等. 食道癌患者体液免疫功能的变化及其影响因素. 中国肿瘤临床与康复，1999，6：54.6，花房秀三郎. 癌遗佾子生物学. 蛋白质、核酸、酵素, 1986,31：1632-1644.7，Olson MO, Thompson BA, Stolp C. Distribution of proteins among chromatin components of nucleoli. Biochemistry, 1983,