扩张床分离 吴慎剑

1、扩张床分离扩张床分离汇报人：吴慎剑汇报人：吴慎剑 日日 期：期：2012.11.7扩张床吸附技术扩张床吸附技术n概述概述n扩张床的吸附原理扩张床的吸附原理n扩张床吸附基质及装置扩张床吸附基质及装置n细胞及碎片对吸附剂性能的影响细胞及碎片对吸附剂性能的影响n扩张床扩张床 操作操作n扩张床扩张床 吸附存在的问题及前景吸附存在的问题及前景一、概述一、概述n它集过滤、浓缩和初步纯化于一步完成，减少了操作它集过滤、浓缩和初步纯化于一步完成，减少了操作步骤，缩短了操作时间，能提高收率和降低成本。步骤，缩短了操作时间，能提高收率和降低成本。 n发酵液或培养液的体积大、黏度高，故处理难、费时发酵液或培养液的体

2、积大、黏度高，故处理难、费时多，常使目标蛋白质受到蛋白酶、糖苷酶的作用而被多，常使目标蛋白质受到蛋白酶、糖苷酶的作用而被破坏。故第一步操作常常成为整个下游过程的制约步破坏。故第一步操作常常成为整个下游过程的制约步骤。骤。 n扩张床吸附技术是一种集成化分离技术，即对已有的扩张床吸附技术是一种集成化分离技术，即对已有的两种单元操作进行有效的组合，组成一种更有效的单两种单元操作进行有效的组合，组成一种更有效的单元操作，以达到提高产品收率，缩短纯化步骤，降低元操作，以达到提高产品收率，缩短纯化步骤，降低纯化费用和投资成本的目的。纯化费用和投资成本的目的。细胞悬浮液具有以下的特点细胞悬浮液具有以下的特点

3、n目标产物浓度普遍比较低；目标产物浓度普遍比较低；n组分非常复杂，是含有细胞、细胞碎片、蛋白组分非常复杂，是含有细胞、细胞碎片、蛋白质、核酸、脂类、糖类和无机盐类等多种物质质、核酸、脂类、糖类和无机盐类等多种物质的混合物；的混合物；n产物易失活，性质不稳定，易被空气氧化、易产物易失活，性质不稳定，易被空气氧化、易受微生物污染、易被蛋白酶水解受微生物污染、易被蛋白酶水解 二、扩张床的吸附原理二、扩张床的吸附原理 n发酵液内含有大量的颗粒，这些颗粒要在进行发酵液内含有大量的颗粒，这些颗粒要在进行层析前除去。目前除去固体颗粒最常用的方法层析前除去。目前除去固体颗粒最常用的方法是离心和过滤。是离心和过

4、滤。n离心和过滤工艺的缺点：离心和过滤工艺的缺点：1.步骤多，累积损失大；步骤多，累积损失大；2.操作时间长，目标产物易失活；操作时间长，目标产物易失活；3.对微米以下的颗粒，特别是对细胞碎片很难有对微米以下的颗粒，特别是对细胞碎片很难有效除去；效除去；4.投入高速离心机和超滤设备，增加了生产成本。投入高速离心机和超滤设备，增加了生产成本。 离心、过滤：步骤多，累积损失大，操作时间长，目标产物易失活，对微米以下的颗粒难除去，设备成本高。相当于一个平衡级，效率差空隙小，易造成堵塞，床层压降增大返混严重平推流，空隙率大，压降小，吸附剂利用率高平推流是理想状态下在流动方向上完全没有返混，而在垂直于流

5、动方向的平面上达到最大程度的混合。 n 上图是全混釜、流化床、扩张床和固定床的上图是全混釜、流化床、扩张床和固定床的操作模式的比较。其中全混釜上料液处于理想操作模式的比较。其中全混釜上料液处于理想混合时，只相当于一个平衡级，其效率比固定混合时，只相当于一个平衡级，其效率比固定床差。一般液固相分离主要采取固定床方式，床差。一般液固相分离主要采取固定床方式，料液流经装有层析介质的柱时在介质层中流动料液流经装有层析介质的柱时在介质层中流动基本上呈平推流，返混小，柱效高。但当料液基本上呈平推流，返混小，柱效高。但当料液中含有固体颗粒时，由于介质问的空隙很小，中含有固体颗粒时，由于介质问的空隙很小，颗粒

6、滞留在介质间，造成堵塞，床层的压降增颗粒滞留在介质间，造成堵塞，床层的压降增大，最终使吸附无法进行，所以采用这种层析大，最终使吸附无法进行，所以采用这种层析方法之前必须对原料液进行固液分离。方法之前必须对原料液进行固液分离。 几个概念几个概念1.最低流化速度最低流化速度 ：料液自下向上运动，当达到某一速度：料液自下向上运动，当达到某一速度时，床层开始扩展，称为最低流化速度时，床层开始扩展，称为最低流化速度 2.终点沉降速度：床层继续随流速的增大而不断扩张，终点沉降速度：床层继续随流速的增大而不断扩张，吸附剂间隙增大，悬浮颗粒能通过，吸附剂仍能保持吸附剂间隙增大，悬浮颗粒能通过，吸附剂仍能保持不

7、被带出的最大流速不被带出的最大流速 3.床层空隙率：扩张床高度与沉降高度之比。床层空隙率：扩张床高度与沉降高度之比。三、扩张床吸附基质特性要求三、扩张床吸附基质特性要求 n吸附剂的尺寸和密度应保证其终端流速与料液中需除吸附剂的尺寸和密度应保证其终端流速与料液中需除去的固形颗粒间有明显的差异；去的固形颗粒间有明显的差异；n吸附剂必须有一定的粒径和密度分布，在扩张床中会吸附剂必须有一定的粒径和密度分布，在扩张床中会形成稳定的分级，从而减小固液相问的返混；形成稳定的分级，从而减小固液相问的返混；n吸附剂应具有良好的孔道结构，不易被料液中的脂类、吸附剂应具有良好的孔道结构，不易被料液中的脂类、核酸和杂

8、蛋白等生物物质污染；核酸和杂蛋白等生物物质污染；n吸附剂应具有特异性吸附的配基，使吸附剂对目标产吸附剂应具有特异性吸附的配基，使吸附剂对目标产物具有较高的吸附容量；物具有较高的吸附容量；n吸附剂应具有较高的化学稳定性和良好的机械强度，吸附剂应具有较高的化学稳定性和良好的机械强度，其中较高的化学稳定性可以保证吸附剂可以承受较苛其中较高的化学稳定性可以保证吸附剂可以承受较苛刻的洗脱条件，而良好的机械强度可延长吸附剂的使刻的洗脱条件，而良好的机械强度可延长吸附剂的使用寿命；用寿命；n吸附剂应具有良好的传质性能，在较高的流速下，可吸附剂应具有良好的传质性能，在较高的流速下，可以保持较高的吸附量。以保持

9、较高的吸附量。 商品化的扩张床商品化的扩张床/流化床介质流化床介质 介质名称介质名称直径直径/ /umum密度密度/(/(g/mL)g/mL)表观液体流速表观液体流速( (cm/min)cm/min)琼脂糖琼脂糖- -石英石英100-300100-3001.151.153.0 3.0 琼脂糖琼脂糖- -金属金属80-16580-1651.31.34.3 4.3 琼脂糖琼脂糖- -不锈钢不锈钢20-4020-403.73.72.5 2.5 琼脂糖琼脂糖- -硅藻土硅藻土200-450200-4501.321.328.8 8.8 琼脂糖琼脂糖- -玻璃玻璃100-300100-3001.3-1.5

10、1.3-1.513.3 13.3 葡聚糖葡聚糖- -二氧化硅二氧化硅100-300100-3001.351.358.0 8.0 纤维素纤维素- -二氧化钛二氧化钛125-600125-6001.21.210.8 10.8 多孔玻璃多孔玻璃130-250130-2502.22.24.0 4.0 (1)共混包埋法共混包埋法n 将增重微粒均匀分散在天然亲水性高分将增重微粒均匀分散在天然亲水性高分子溶液中，通过溶解、结晶、再生等手子溶液中，通过溶解、结晶、再生等手段得到多孔基质。琼脂糖和纤维素都存段得到多孔基质。琼脂糖和纤维素都存在明显的链聚集结晶区域，结晶再生时在明显的链聚集结晶区域，结晶再生时能形

11、成稳定的多孔网络结构，并能将增能形成稳定的多孔网络结构，并能将增重材料包埋其中。重材料包埋其中。3.扩张床吸附基质的制备扩张床吸附基质的制备 如将含纤维素的黄原胶溶液与含微米级如将含纤维素的黄原胶溶液与含微米级TiO2颗颗粒的水溶液共混，升温溶解，然后在甲醇溶液粒的水溶液共混，升温溶解，然后在甲醇溶液中再生，即得到混合型的基质，但由于机械强中再生，即得到混合型的基质，但由于机械强度不够，需要进行后交联反应增强基质的强度。度不够，需要进行后交联反应增强基质的强度。由于基质是经过研磨后筛分而得，形状并不一由于基质是经过研磨后筛分而得，形状并不一致，这会影响扩张时的流体力学特性。另外，致，这会影响扩

12、张时的流体力学特性。另外，TiO2微粒随机分散在纤维素骨架的网络结构中，微粒随机分散在纤维素骨架的网络结构中，也会影响蛋白质分子的传质效果。也会影响蛋白质分子的传质效果。n (2)反相悬浮聚合法反相悬浮聚合法 采用反相悬浮聚合法将亲水性的不锈钢、二氧采用反相悬浮聚合法将亲水性的不锈钢、二氧化钛、二氧化锆等增重内核或微核包埋在亲水化钛、二氧化锆等增重内核或微核包埋在亲水性的天然高分子骨架中。例如使用石蜡油作分性的天然高分子骨架中。例如使用石蜡油作分散相、散相、Span85作乳化剂，将不锈钢微珠分散作乳化剂，将不锈钢微珠分散在琼脂糖的水溶液中，控制搅拌速度以获得不在琼脂糖的水溶液中，控制搅拌速度以

13、获得不同的琼脂糖厚度，逐步降温冷却可获得高密度同的琼脂糖厚度，逐步降温冷却可获得高密度核壳型基质。如果在水相中加入交联剂核壳型基质。如果在水相中加入交联剂(如环如环氧氯丙烷氧氯丙烷)，则可实现反相悬浮交联，基质的，则可实现反相悬浮交联，基质的强度进一步提高，而孔隙率并不受到明显的影强度进一步提高，而孔隙率并不受到明显的影响。响。n(3)悬浮聚合法悬浮聚合法n 将增重用的亲水性不锈钢、二氧化钛等无机将增重用的亲水性不锈钢、二氧化钛等无机物进行表面改性处理，利用悬浮聚合将其包埋物进行表面改性处理，利用悬浮聚合将其包埋于高分子共聚物中。由于共聚的单体是有机亲于高分子共聚物中。由于共聚的单体是有机亲油

14、性的，而增重剂都是无机亲水性的，两者相油性的，而增重剂都是无机亲水性的，两者相溶性较差，聚合过程中易发生相分离，对增重溶性较差，聚合过程中易发生相分离，对增重剂有机化表面改性的效果直接决定了能否较大剂有机化表面改性的效果直接决定了能否较大地提高颗粒的密度。地提高颗粒的密度。n (4)表面改性法表面改性法1.化学改性：通过化学反应改变聚合物的化学改性：通过化学反应改变聚合物的物理、化学性质的方法。物理、化学性质的方法。2.共聚物改性共聚物改性4.扩张床吸附装置扩张床吸附装置n基本结构与固定床一样基本结构与固定床一样n上下分布器要求：分布器只上下分布器要求：分布器只能让流体垂直向上流过能让流体垂直

15、向上流过 ；剪；剪应力控制在最小的范同内，应力控制在最小的范同内，以防止产物变性以防止产物变性 ；细胞或细；细胞或细胞碎片不易滞留；方便清洗胞碎片不易滞留；方便清洗 。n吸附柱设计吸附柱设计 要求：减小液相要求：减小液相返混程度返混程度 5.细胞及碎片对吸附剂性能的细胞及碎片对吸附剂性能的影响及评价影响及评价 研究表明，若细胞或细胞碎片等生物颗粒吸附在介研究表明，若细胞或细胞碎片等生物颗粒吸附在介质上，将严重影响介质对目标物的吸附。下表列出了一些质上，将严重影响介质对目标物的吸附。下表列出了一些生物颗粒在不同吸附介质表面的吸附情况，可见主要是静生物颗粒在不同吸附介质表面的吸附情况，可见主要是静

16、电力在起作用。电力在起作用。 在设计过程中，应该考虑把生物颗粒的影响引入到扩在设计过程中，应该考虑把生物颗粒的影响引入到扩张床的过程设计中，在过程开发的早起就同时兼顾张床的过程设计中，在过程开发的早起就同时兼顾“目标目标物的吸附物的吸附”和和“生物颗粒顺吸附剂互相作用生物颗粒顺吸附剂互相作用”，及时发现，及时发现并排除生物颗粒的负面影响，确保扩张床吸附过程的顺利并排除生物颗粒的负面影响，确保扩张床吸附过程的顺利实施。实施。生物颗粒生物颗粒StreamlineStreamline扩张床吸附剂扩张床吸附剂基质基质苯基苯基阴离子阴离子阳离子阳离子强化阴强化阴离子离子染料亲染料亲和和蛋白蛋白A A亲亲

17、和和面包酵母面包酵母一一一一一一十十十十一一一一十十十十一一一一面包酵母匀浆液面包酵母匀浆液一一一一一一十十一一一一十十十十一一一一大肠杆菌大肠杆菌一一一一一一一一一一十十一一一一大肠杆菌匀浆液大肠杆菌匀浆液一一一一十十一一一一十十一一一一一一一一葡萄球菌葡萄球菌一一一一一一十十一一一一十十十十一一一一杂交瘤细胞杂交瘤细胞一一一一十十十十十十十十十十十十一一一一十十十十十十一一一一生物颗粒在不同吸附剂表面的吸附生物颗粒在不同吸附剂表面的吸附n亲和力种类：静电引力；疏水性作用。亲和力种类：静电引力；疏水性作用。n危害：危害：1.使吸附剂发生聚集使吸附剂发生聚集 2.破坏扩张床的稳定分级结构破坏扩

18、张床的稳定分级结构 3.削弱分离效果削弱分离效果 4.床层的崩溃床层的崩溃 n评价方法评价方法 ：生物颗粒静态吸附法、生物颗粒：生物颗粒静态吸附法、生物颗粒脉冲响应法和停留时间分布脉冲响应法和停留时间分布(RTD)分析法。分析法。n生物颗粒静态吸附法：生物颗粒静态吸附法：n生物颗粒脉冲响应法。生物颗粒脉冲响应法。nRTD分析法。分析法。 扩散系数扩散系数表示气体（或固体）扩散程度的物理量。表示气体（或固体）扩散程度的物理量。扩散系数是指当浓度为一个单位时扩散系数是指当浓度为一个单位时,单位时间内通过单位时间内通过单位面积的气体量。单位面积的气体量。6.扩张床操作扩张床操作n平衡平衡(equil

19、ibration)、n吸附吸附(adsorption)、n冲洗冲洗(washing)、n洗脱洗脱(elution)n在位清洗在位清洗(clean in place) n1)平衡平衡n 扩张床在首次吸附操作前须用平衡缓冲液扩张，逐扩张床在首次吸附操作前须用平衡缓冲液扩张，逐渐增大流速，让扩张床扩张到一定程度，大约渐增大流速，让扩张床扩张到一定程度，大约30min后达到平衡。后达到平衡。n扩张率过低，会造成料液中固体颗粒通过的困难；扩扩张率过低，会造成料液中固体颗粒通过的困难；扩张率过高，会造成配基对目标产物的吸附效率下降。张率过高，会造成配基对目标产物的吸附效率下降。n扩张床的吸附操作中最适宜的

20、扩张率为扩张床的吸附操作中最适宜的扩张率为23。流速。流速300 cmh-1时，用缓冲液扩张到固定床高度两倍的扩时，用缓冲液扩张到固定床高度两倍的扩张床吸附性能较好。扩张床内吸附剂的填充高度在张床吸附性能较好。扩张床内吸附剂的填充高度在10 cm以上，可以消除进口区域不均匀流化的影响，得到以上，可以消除进口区域不均匀流化的影响，得到稳定的床层和较低的返混程度。操作过程中，层析柱稳定的床层和较低的返混程度。操作过程中，层析柱必须保持垂直，否则易发生不同层次之间的混合。必须保持垂直，否则易发生不同层次之间的混合。 n 2)吸附吸附 在吸附前，需先用平衡液将沉积的吸附剂流态化，建在吸附前，需先用平衡

21、液将沉积的吸附剂流态化，建立一个稳定的床层。然后，将平衡液切换成原料液，立一个稳定的床层。然后，将平衡液切换成原料液，由于原料液的黏度、密度和固体颗粒含量与平衡缓冲由于原料液的黏度、密度和固体颗粒含量与平衡缓冲液不同，若维持原来的操作条件不变，床的扩张率会液不同，若维持原来的操作条件不变，床的扩张率会增大。为了保持一定的扩张率，起先需降低流速以保增大。为了保持一定的扩张率，起先需降低流速以保持床高；而在吸附操作的后期，由于介质吸附的蛋白持床高；而在吸附操作的后期，由于介质吸附的蛋白质、细胞、核酸等生物物质，密度会有所增加，此时质、细胞、核酸等生物物质，密度会有所增加，此时需要提高流速来维持原来

22、的扩张率。在实际的吸附操需要提高流速来维持原来的扩张率。在实际的吸附操作中，也可以采用维持流体流速，根据扩张高度的变作中，也可以采用维持流体流速，根据扩张高度的变化，调节扩张床内的高度调节器。化，调节扩张床内的高度调节器。 n3)冲洗冲洗n目的：除去床层间滞留的细胞和细胞碎片；除去非结目的：除去床层间滞留的细胞和细胞碎片；除去非结合或弱结合性的可溶杂蛋白。合或弱结合性的可溶杂蛋白。n除去颗粒杂质冲洗时，流向与吸附时相同，采用的流除去颗粒杂质冲洗时，流向与吸附时相同，采用的流体开始时大多使用平衡缓冲液。整个冲洗过程一般需体开始时大多使用平衡缓冲液。整个冲洗过程一般需要要520倍沉降床体积的缓冲液

23、。倍沉降床体积的缓冲液。n洗涤液的黏度或密度较低，会使床层不稳定。用洗涤液的黏度或密度较低，会使床层不稳定。用25甘油溶液洗涤，效果较好，由于其黏度和密度较大，甘油溶液洗涤，效果较好，由于其黏度和密度较大，洗涤液呈活塞流，能有效地将细胞颗粒洗出而对床层洗涤液呈活塞流，能有效地将细胞颗粒洗出而对床层的稳定性无影响。流出液中观测不到固体杂质时可继的稳定性无影响。流出液中观测不到固体杂质时可继续保持扩张床方式，也可改用固定床方式，因为采用续保持扩张床方式，也可改用固定床方式，因为采用扩张床流体速度限制在最小流化和夹带速度之间，固扩张床流体速度限制在最小流化和夹带速度之间，固定床的低速不受限制，此时缓

24、冲液流向取决于操作方定床的低速不受限制，此时缓冲液流向取决于操作方式。注意调节上部速率分布器的位置比床层上界面高式。注意调节上部速率分布器的位置比床层上界面高出出0.51.0 cm。 n 4)洗脱洗脱n固定床方式洗脱是缓冲液从扩张床顶泵入，以固定床方式洗脱是缓冲液从扩张床顶泵入，以固定床方式向下洗脱；固定床方式向下洗脱；n优点：减少洗脱缓冲液的用量，增加产物浓度，优点：减少洗脱缓冲液的用量，增加产物浓度，减少残留在床内的细胞对产物的污染，减少残留在床内的细胞对产物的污染，n缺点：洗脱时间比较长，洗脱操作复杂，需缺点：洗脱时间比较长，洗脱操作复杂，需要调节高度调节器和反向进样；操作时膨胀要调节高

25、度调节器和反向进样；操作时膨胀介质会产生聚集，影响其再度膨胀，造成在位介质会产生聚集，影响其再度膨胀，造成在位清洗的困难；床层压降高，对介质的机械强清洗的困难；床层压降高，对介质的机械强度要求高。度要求高。n扩张床方式洗脱是缓冲液从扩张床底部扩张床方式洗脱是缓冲液从扩张床底部泵入，进行向上洗脱。泵入，进行向上洗脱。n优点：洗脱方式简单，洗脱迅速；优点：洗脱方式简单，洗脱迅速；可减少返压；不会造成吸附剂颗粒的可减少返压；不会造成吸附剂颗粒的聚集，提高清洗效率；洗脱设备简单；聚集，提高清洗效率；洗脱设备简单；可实现连续化生产。可实现连续化生产。 n 5)清洗清洗 n包括吸附剂的再生包括吸附剂的再生

26、(Regeneration)和扩张床和扩张床的消毒的消毒(Sanitization)。n再生是维持吸附剂的吸附能力和确保所有杂质再生是维持吸附剂的吸附能力和确保所有杂质都被清除的必要环节都被清除的必要环节 n杂质的危害：降低介质的吸附容量，特别是反杂质的危害：降低介质的吸附容量，特别是反复使用的介质，严重时还会导致吸附剂的集聚，复使用的介质，严重时还会导致吸附剂的集聚，出现沟流，影响扩张床的混合特性出现沟流，影响扩张床的混合特性 n小分子小分子n链霉素发酵液的不过滤直接用离子交换分离提取，其链霉素发酵液的不过滤直接用离子交换分离提取，其分离过程是链霉素发酵结束后仅先酸化后中和，而不分离过程是链霉素发酵结束后仅先酸化后中和，而不过滤除去菌丝及固形物，直接从交换柱的下部，以表过滤除去菌丝及固形物，直接从交换柱的下部，以表观流速观流速115146 cmh叫送入柱中进行吸附，含菌丝叫送入柱中进行吸附，含菌丝及固形物的残液从柱上部流及固形物的残液从柱上部流H，待穿透后切断进料，待穿透后切断进