双歧杆菌脂磷壁酸延缓细胞衰老的作用机制

1、双歧杆菌脂磷壁酸延缓细胞衰老的作用机制        【摘要】目的 探讨双歧杆菌脂磷壁酸（Lipoteichoic acid，LTA）在延缓H2O2诱导细胞衰老中的作用。方法 H2O2诱导WI38细胞衰老，半乳糖苷酶细胞化学染色计算衰老细胞百分率变化，RTPCR和Western印迹检测衰老细胞p21、细胞周期蛋白E（cyclin E）和周期蛋白依赖性蛋白激酶2（CDK2）表达水平的变化。结果 双歧杆菌LTA处理后，半乳糖苷酶细胞化学染色阳性细胞百分率较衰老模型组降低（P0.01)。与年轻对照组相比，衰老模型组细胞中

2、p21的表达增高，cyclin E和CDK2表达降低，而双歧杆菌LTA能够逆转上述变化（P0.01)。结论 双歧杆菌能延缓H2O2诱导的细胞衰老,机制可能与改变p21，cyclin E和CDK2表达水平有关。 Effect and mechanism of lipoteichoic acid of Bifidobacterium on delaying cell aing PENG YanHua, WANG Yue, LIU JianLong, et al. Key Laboratory of Laboratory Medical Diagnostics of Ministry of Educ

3、ation, Department of Laboratory Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China 【Abstract】 Objective To explore the effect of lipoteichoic acid (LTA) of Bifidobacterium on delaying cell aging induced by H2O2. Methods WI38 cell aging was induced by H2O2. galactosidase (gal) cytochemis

4、try staining was used to evaluate the percent of aging cell and the mRNA and protein levels of p21, cyclin E and CDK2 were detected by RTPCR and Western blot. Results Treatment with LTA（5, 10 g/ml）led to a significant increase in the proportion of galpositive cells (P0.01) and markedly decreased the

5、 mRNA and protein levels of p21 and increased the mRNA and protein levels of cyclin E and CDK2 in WI38 cells in aging model group (all P0.01). Conclusions LTA of Bifidobacterium can delay cell aging induced by H202, whose mechanism may have relation with change the expressions of p21, cyclin E and C

6、DK2. 【Key words】 Bifidobacterium; Lipoteichoic acid; Cellaging; H2O2 在体外，人胚肺二倍体成纤维细胞已成为经典的复制性细胞衰老模型，而多种刺激物能诱导年轻细胞出现与复制性衰老相似的特征，被称为应激诱导早熟性老化(stressinduced premature senescence，SIPS)，其中H2O2是最常用的氧化应激引发细胞SIPS诱导剂1，2。双歧杆菌的表面分子脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)已被证实具有抗氧化的作用，能够有效延缓衰老3，但其机制并不是很清楚。本研究用H2O2诱导人胚肺成纤维细胞W

7、I38出现SIPS,观察双歧杆菌LTA是否具有抗细胞衰老的作用，以及WI38细胞中p21、CDK2和cyclin E mRNA和蛋白表达水平的变化，探讨双歧杆菌LTA抗细胞衰老的细胞周期调控机制。 1 材料和方法 1.1 材料 双歧杆菌LTA由本实验室参考Sutcliffe法4从两歧双歧杆菌中提取，人胚肺成纤维细胞WI38细胞（20代）购于中国科学院细胞库，胎牛血清和MEM培养基购自美国Gibco公司，H2O2购自Sigma公司；p21、CDK2、cyclin E和GAPDH引物序列由Invitrogen公司合成，RTPCR试剂盒购自Promega公司，p21、cyclin E单克隆抗体和CD

8、K2多克隆抗体购自北京中山公司，衰老特异性半乳糖苷酶原位染色试剂盒，购自上海杰美公司，Western印迹化学发光检测试剂盒购自美国KPL公司。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 WI38细胞接种于含10%胎牛血清的MEM培养基(另外加入2 mmol/L谷氨酰胺，1.0 mmol/L丙酮酸钠，0.1 mmol/L非必需氨基酸)，置37，5% CO2条件下培养至2235代用于实验。 1.2.2 细胞处理5和分组 模型组将细胞接种于24孔培养板，每孔2?05个细胞，待细胞长满培养板的70左右（避免细胞汇合），加160 mol/L H2O2作用2 h，用无血清培养基清洗3次，再加入10%胎牛血清的培

9、养基培养72 h；双歧杆菌LTA处理组在加160 mol/L H2O2同时分别加入5、10、20 g/ml LTA, 同时做年轻对照组。 1.2.3 半乳糖苷酶细胞化学染色 按照说明书操作，染成蓝色的细胞为半乳糖苷酶染色阳性细胞,每组同时做4个复孔，每孔计数400个细胞，计算半乳糖苷酶染阳性百分率。 1.2.4 p21、cyclin E和CDK2 mRNA表达水平 逆转录参阅Promega RT说明书:2 g RNA0.5 g olig（dT）无RNAase水，终体积15 l，70 变性5 min，立即放进冰中冷却，随后在上述体系中加入MMLV 1 l，dNTP 1.25 l，RNAase 0

10、.6 l，MMLV 5缓冲液 5 l，加水至25 l，42 60 min，95 5 min，冰浴5 min。PCR的反应体系：PCR缓冲液5 l,MgCl2 1.8 l,灭菌水19.4 l, Promega Taq酶0.2 l,上游引物1 l,下游引物1 l, dNTP 0.6 l,cDNA 2 l,共30 l。引物序列见表1。PCR反应条件：为94 3 min预变性；94 35 s，59     35 s(p21，cyclin E和CDK2), 61 30 s(GAPDH),72 45 s,32个循环；72 5 min；取PCR扩增产物5 l上样于10

11、 g/L琼脂糖电泳，在BioRad凝胶成像仪上观察并保存结果,光密度分析。表1 引物序列及扩增产物大小（略） 1.2.5 p21、cyclin E和CDK2蛋白表达水平 处理后的细胞用预冷的细胞裂解液提取蛋白,用蛋白提取液样品作SDSPAGE电泳后转膜，封闭, 转至PVDG膜，室温下封闭2 h后，一抗(1200稀释)4下孵育过夜，0.01 mol/L PBST洗涤5次，每次5 min，与二抗(11 000稀释)室温下孵育2 h，洗涤后用ECL化学发光系统检测，待条带显示清楚后终止反应。结果用quantity one软件分析。 1.3 统计学处理 实验数据以x眘表示，采用SPSS 12.0软件分

12、析，多组间均数比较用单因素方差分析。 2 结 果 2.1 双歧杆菌LTA对H2O2诱导细胞衰老的影响 衰老模型组的半乳糖苷酶阳性细胞率(71%)明显高于青年对照组(10%)和5 g/ml LTA处理组(21%)及10 g/ml LTA处理组(35%)(P0.01)，表明双歧杆菌LTA能够延缓由H2O2诱导的细胞衰老，但20 g/ml LTA处理组(69%)无明显作用。见图1。 2.2 双歧杆菌LTA对WI38细胞中p21、cyclin E和CDK2 mRNA表达的影响 与年轻对照组比较，模型组WI38细胞的p21 mRNA表达显著增加（P0.01），cyclin E和CDK2 mRNA表达明显

13、下降（P0.01）；经5 g/ml和10 g/ml双歧杆菌LTA处理后，其细胞内p21 mRNA表达较模型组明显下降（P0.01），cyclin E和CDK2 mRNA表达较模型组明显增高（P0.01），其中尤以5 g/ml LTA组变化最明显。见表2、图2。表2 双歧杆菌LTA对WI38细胞中p21、cyclin E和CDK2 mRNA表达的影响(略) 2.3 双歧杆菌LTA对H2O2诱导WI38细胞衰老过程中蛋白表达的影响 与年轻对照组比较，模型组WI38细胞的p21 蛋白表达显著增加（P0.01），cyclin E和CDK2 蛋白表达明显下降（P0.01）；经5 g/ml和10 g/ml

14、双歧杆菌LTA处理后，CDK2、p21 mRNA表达的影响 其细胞内p21蛋白表达较模型组明显下降（P0.01），cyclin E和CDK2 蛋白表达较模型组明显增高（P0.01），其中尤以5 g/ml LTA组变化最明显。见表3、图3。表3 双歧杆菌LTA对WI38细胞p21、Cyclin E、CDK2蛋白表达的影响(略) 3 讨 论 氧化应激是指机体活性氧的产生过多或(和)机体抗氧 化能力下降，活性氧(ROS)清除不足，导致ROS在体内增多并引起细胞氧化损伤的病理过程。ROS包括超氧阴离子(O2)、羟自由基(OH?、H2O2等。在体外,H2O2引发细胞氧化应激损伤,诱导细胞衰老,是最常用的

15、诱导剂。本实验结果发现，用亚致死量的160 mol/L H2O2处理WI38细胞可诱导细胞SIPS，其半乳糖苷酶细胞化学染色阳性细胞百分率较年轻对照组明显增高,而用双歧杆菌LTA处理后，半乳糖苷酶阳性细胞百分率较模型组明显降低，其中尤以5 、10 g/ml双歧杆菌LTA处理组降低最为明显，而20 g/ml双歧杆菌处理组无明显变化，显示出一定的浓度依赖性，表明双歧杆菌LTA能延缓H2O2诱导的细胞衰老。 细胞周期是细胞生命活动的基本过程，细胞在周期时相的变迁中进入增殖、分化、衰老和死亡等生理状态。细胞周期沿着G1期S期G2期M期的顺序进行运转。G1期是启动细胞周期循环的关键，当细胞复制性衰老时，

16、生长停滞，主要分布在G1期。当细胞被诱导衰老时，也具有相同的特征。Gorbunova等6认为H2O2诱导的细胞衰老主要是由于DNA损伤引起。对DNA损伤所引起的反应细胞阻滞于G1期。在整个G1期，细胞在不同时相受到各自周期蛋白(cyclin)和周期蛋白依赖激酶(CDK)的凋节，其中cyclin E是调控细胞周期从G1期进入S期的关键。cyclin E首先激活CDK2，cyclin ECDK2的磷酸化活性使Rb磷酸化，释放转录因子E2F，促使DNA合成，导致细胞由G1期进入S期，进行有序的运转。因此，提高cyclin E和CDK2的表达，可以促进细胞由G1期进入S期。而抑制CDK2的活性，也能阻

17、止细胞进入S期7。p21作为一个广谱的CDK抑制剂和细胞周期的负调控因子，能抑制cyclin ECDK2的磷酸化活性，使细胞停滞在G1期，从而诱发细胞衰老的特征性改变8。本研究发现，经H2O2诱导的WI38细胞出现SIPS，其细胞中p21表达明显增加，cyclin E和CDK2表达显著下降，而双歧杆菌LTA能够明显逆转上述细胞周期调节因子的变化，表明其可以通过增强细胞周期的正向调节并抑制细胞周期的负向调节，从而发挥延缓细胞衰老的作用。 【参考文献】 1 Toussaint O, Medrano EE, von Zglinicki T. Cellular and molecular mechan

18、isms of stressinduced premature senescence (SIPS) of human diploid fibroblasts and melanocytesJ. Exp Gerontol, 2000; 35(8):92745. 2 Duan J, Duan J, Zhang Z, et al. Irreversible cellular senescence induced by prolonged exposure to H2O2 involves DNAdamageandrepair genes and telomere shorteningJ. Int J Biochem Cell Biol，2005; 37(7):140