哮喘儿童外周血T淋巴细胞FasFasL的表达及其意义

1、哮喘儿童外周血T淋巴细胞Fas/FasL的表达及其意义                   作者：袁岳沙  陈杰 王琳 周少华 【摘要】  目的探讨哮喘儿童外周血T淋巴细胞Fas、FasL表达及其意义。方法21例哮喘发作期患儿、15例哮喘缓解期患儿及25例正常儿童作为研究对象；密度梯度法分离外周血淋巴细胞；免疫荧光抗体法检测淋巴细胞Fas、FasL表达阳性率；用t检验和直线相关分析进行资料统计处理

2、。结果发作期患儿淋巴细胞Fas表达明显下降，与正常对照组和缓解期患儿组比较差异均有非常显着意义（t=5.914 2， 3.108 4, P0.01）；缓解期患儿淋巴细胞Fas表达比发作期患儿有明显提高，但与正常组相比仍有显着降低（t=2.338 8, P0.05）；淋巴细胞FasL表达总体均较低，但在发作期患儿仍明显高于正常对照组（t=2.186 1, P0.05），在缓解期患儿FasL表达虽高于正常对照组，但无统计学意义（t=1.772 4, P0.05）；发作期患儿外周血中表达Fas的淋巴细胞阳性率与淋巴细胞比率呈明显的负相关（r=-0.632, P0.05），而表达FasL的淋巴细胞阳性

3、率与淋巴细胞比率间无明显相关性。结论哮喘发作期和缓解期儿童存在淋巴细胞凋亡下降，这可能是哮喘患儿气道慢性炎症持续存在的原因；同时提示在缓解期患儿仍需继续维持治疗。 【关键词】  哮喘 儿童 淋巴细胞 Fas(CD95) FasLAbstract：ObjectiveTo investigated the expression of Fas/FasL on peripheral blood T cells in asthmatic children and  to explore the relationship between its clinical significanc

4、e. MethodsLymphocytes were isolated with ficoll-hypaque gradient method and T lymphocytes were further purified with nylon pili. Expression of Fas/FasL was detected by immunofluoresence technology.ResultsExpression of Fas on T cells in 21 cases of the stage of attack (5.81±3.29) and in 15 cases

5、 of remission stage (9.86±4.54) were remarkably lower than those in 25 healthy children (13.72±5.33) (P0.01). Expression of FasL on T cells in the stage of attack (3.22±1.74) was significantly increased compared with normal control group (2.31±1.05) (P0.05) but those in remission

6、 patients (2.97±1.28) was not significantly changed. There was a remarkable negative relationship between expression of Fas and percentages of peripheral blood lymphocyte (r=-0.632, P0.01).ConclusionThe apoptosis of peripheral blood T lymphocytes from the children with asthma both in stage of a

7、ttack and remission are decreased. The inhibited apoptosis might be one of reasons for the chronic persistent inflammation in the airways in asthmatic children and suggests that it is necessary to continue therapy in remission stage.Key words： Asthma；   Child；   Lymphocyte ； 

8、; Fas；  FasL   支气管哮喘以可逆性气道阻塞、气道高反应性、气道炎症为其三大主要特征，其中以气道炎症为最主要的病理变化，并决定气道阻塞和气道高反应性的程度1。这种气道慢性变态反应性炎症是以嗜酸细胞、淋巴细胞及肥大细胞浸润为主的。最近研究表明，淋巴细胞凋亡与激活的调节失衡可能起到重要作用2。本课题组近期对哮喘儿童外周血T淋巴细胞Fas/FasL表达的变化进行了研究，以探讨其在哮喘中的作用。 1   对象与方法1  对象哮喘发作期21例，男14例，女7例，年龄312岁；缓解期15例，男9例，女6例，年龄312岁；所有

9、患儿均符合全国哮喘诊断标准3，均于采血前1周内未使用糖皮质激素。同期体检健康儿童25例作为对照，男14例，女11例，年龄312岁。2  方法 外周血淋巴细胞分离：无菌取静脉血肝素抗凝，加等量Hanks液稀释，用Ficoll淋巴细胞分离液分离，用含10%胎牛血清（FBS, Sigma产品）的RpMI 1640培养液（GIBCO产品）配成细胞悬液，细胞浓度为5×109/L，于培养瓶中37 贴壁培养2 h，用无菌尼龙棉柱37 作用30 min，分离出T淋巴细胞，其纯度90%，锥虫蓝拒染试验活细胞数90%。   淋巴细胞Fas/FasL的表达：重悬的淋巴细胞离心

10、，去上清，分别与鼠抗人Fas、FasL单克隆抗体于4 孵育，以非免疫鼠IgG作为阴性对照，45 min后洗涤细胞，加入异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗鼠IgG（抗体均为phar Mingen产品），于4 避光孵育45 min，洗涤细胞，检测阳性细胞率。3  统计学处理 淋巴细胞Fas、FasL阳性率用均数±标准差（x±s）表示，组与组的比较采用t检验，Fas、FasL阳性率与外周血淋巴细胞比率的相关性比较采用直线相关分析。         2  结果  

11、; 患儿与正常儿童淋巴细胞Fas、FasL阳性率的比较：从表1可以看出，哮喘发作期患儿淋巴细胞Fas表达明显下降，与正常对照组和缓解期患儿组比较差异均有非常显着意义（t=5.914 2， 3.108  4, P0.01）；缓解期患儿淋巴细胞Fas表达比发作期患儿有明显提高，但与正常组相比仍有显着降低（t=2.338 8, P0.05）；淋巴细胞FasL表达总体均较低，但在发作期患儿仍明显高于正常对照组，差异有显着意义（t=2.186 1, P0.05），在缓解期患儿FasL表达虽高于正常对照组，但无统计学意义（t=1.772 4, P0.05）。表1  哮喘患儿与正常儿外周

12、血淋巴细胞Fas、FasL阳性率比较（略）与对照组比较，P0.01；与缓解期比较，P0.01；与对照组比较，P0.05     表达Fas、FasL的淋巴细胞阳性率与外周血淋巴细胞比率的相关性比较：哮喘发作期患儿外周血中表达Fas的淋巴细胞阳性率与淋巴细胞比率呈明显的负相关（r=-0.632, P0.05），而表达FasL的淋巴细胞阳性率与淋巴细胞比率间无明显相关性。3   讨论   人的Fas（即CD95）属于TNF和NGF受体家族，包含325个氨基酸，其基因位于第10号染色体的长臂上。Fas抗原主要在外周血CD4+、CD

13、8+、B细胞、少数NK细胞、骨髓细胞系和部分组织上表达。而Fas抗原配体（FasL）是一种分子量为40KD的II型跨膜糖蛋白，也属于TNF家族成员，它主要在激活的T淋巴细胞和B淋巴细胞上表达。Fas和FasL结合可以诱发细胞凋亡。首先使Fas形成能传递信号的活性形式三聚体，其在胞内的死亡结构（Death Domain）与Fas死亡结构域相关蛋白（Fasassociated Death Domain, FADD）形成二聚体而相互作用，该结构负责将凋亡信号传递至一种凋亡蛋白酶Caspase8，使其激活，于是细胞发生凋亡。4   疾病状态可影响Fas的表达，使细胞凋亡过程发生改变

14、。支气管哮喘是儿科较常见的疾病，其病理过程是以嗜酸细胞、淋巴细胞及肥大细胞浸润为主的气道慢性变态反应性炎症。国内外最近已有报道，哮喘患者淋巴细胞凋亡与激活的调节失调可能在病理方面起着重要作用。T淋巴细胞是体内发挥免疫调节作用最重要的细胞成分，支气管哮喘的发病机制主要与T1/T2型细胞因子比例密切失衡相关5，近年来许多学者对淋巴细胞凋亡的机制研究的也较为深入。刘春涛等6研究发现白三烯受体拮抗剂和糖皮质激素均通过Fas和caspase3途径诱导EOS和淋巴细胞凋亡，提示在抑制气道炎症中两者的活性有部分重叠。而Spinozzi及其同事们在对哮喘患者的研究中发现，无论是在发作期还是在缓解期，其淋巴细胞

15、CD95的表达均显着低于正常对照，其BALF中T淋巴细胞几乎无CD95表达。近来也有学者通过基因工程技术表达FasL的树状细胞来调节哮喘的表现，结果证明可明显减少AHR 7 。本研究结果显示：在发作期和缓解期患儿外周血淋巴细胞Fas阳性率均明显低于正常儿童（P0.01），缓解期虽有所回升，但仍明显低于正常对照组（P0.05），表达Fas的淋巴细胞阳性率与外周血淋巴细胞比率间存在显着的负相关关系（P0.01）。这提示在哮喘患儿淋巴细胞增多是由于淋巴细胞CD95介导的凋亡减少所致。   有学者报道哮喘患者和健康者外周血中淋巴细胞FasL表达均较低。淋巴细胞的凋亡受到凋亡相关基因

16、及细胞内凋亡信号转导分子的调控，但对Fas介导的凋亡最为敏感。有资料显示，T细胞Fas表达水平低下，Fas/Fasl相互作用减弱，可导致T细胞凋亡障碍2。本实验结果显示，在哮喘发作期和缓解期以及正常儿童外周血淋巴细胞FasL表达均较低，但是，在发作期患儿仍明显高于正常对照组（P0.05），缓解期患儿虽比正常儿增高，但无统计学意义。Krug等证实FasL表达增加是致敏淋巴细胞受到变应原刺激后的反应8。以上结果同时也提示，即使在缓解期，患儿淋巴细胞Fas/FasL的表达改变仍未恢复到正常，临床上继续维持治疗是必要的。【参考文献】  1 Haley KJ, Drazen JM. Infla

17、mmation and airway function in asthma: what you see is not necessarily what you get. J .Am J Respir Crit Care Med. 1998 Jan;157(1):1.2 Spinozzi F, Fizzotti M, Agea E, et al. Defective expression of Fas messenger RNA and Fas receptor on pulmonary T cells from patients with asthma. J .Annal Intern Med

18、, 1998,128(5):363.3 全国儿科哮喘防治协作组. 儿童哮喘防治常规. J . 中华儿科杂志，1998，36(12)：747.4 袁 红. Fas/FasL与凋亡研究进展. J .国外医学，生理病理科学与临床分册，2000,20(1):26.5 Varga EM，Wachholz P，Nouri AK，et al.T cells from human allergeninduced late asthmatic responses express IL12 receptor beta 2 subunit mRNA and respond to IL12 in vitro. J . J Immunol,2000,165(5):28776 刘春涛,罗凤鸣,冼乐武,等.支气管哮喘患者外周血炎性细胞凋亡的研究. J . 中华结核和呼吸杂志,2003,26(10):613.7 7. Chuang YH, Suen JL, Chiang BL. Fasligandexpressing adenovirustransfected dendritic cells decrease allerg