免疫胶体金法快速检测动物源性食品中氯霉素残留的研究

1、免疫胶体金法快速检测动物源性食品中氯霉素残留的研究张燕王玮刘俊伟王硕(天津科技大学食品工程与生物技术学院天津市食品营养与安全重点实验室天津300457摘要目的:优化建立渗滤式(Flow through 和侧流式(Lateral flow 两种金标记免疫竞争快速筛选方法。方法:采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,标记氯霉素多克隆抗体,以硝酸纤维素膜为载体,包被氯霉素半抗原与卵清蛋白的偶联物作为检测带,经过竞争反应后目测结果。结果:通过简单的样品前处理方法,消除了基质影响,可成功用于猪肉、鸡肉和鳕鱼样品中痕量氯霉素残留的快速检测。检测标准溶液及组织试样的提取稀释液时,灵敏度分别为0.8g/L 和1g/

2、L 。几种氯霉素的结构类似物及常见兽药对氯霉素检测均无干扰,通过酶联免疫吸附定量检测方法验证了2种快速筛选方法的有效性,加速稳定性试验证明渗滤式金标试纸条在4下6个月内可保持检测结果的可靠性。结论:所建立的方法操作简单,快速,灵敏度高,稳定性好,可作为动物源性食品中氯霉素残留现场大量筛选的有效手段。关键词氯霉素胶体金渗滤式侧流式文章编号1009-7848(200901-0196-05氯霉素(chloramphenicol ,CAP 是一种高效广谱抗生素,常用于动物各种传染性疾病的治疗1,但氯霉素对人体有严重的毒副作用24。目前美国和欧共体已禁止在食用性动物中使用氯霉素,并规定在动物源性食品中不

3、得检出。我国农业部在2002年12月第235号公告动物性食品中兽药最高残留限量中规定氯霉素为禁用药物,在动物性食品中不得检出。因此,发展快速灵敏的检测技术已成为氯霉素残留检测的研究焦点。1971年Faulk 和Taylor 5将胶体金应用于免疫化学中,使胶体金在生物医学、食品安全、环境保护等诸多领域得到广泛应用。20世纪80年代末期,人们把胶体金免疫技术与固相膜结合,建立了胶体金免疫快速检测方法。目前常见的检测形式有:渗滤式(Flow through 和侧流式(Lateral flow 6。本文研究2种胶体金标记试纸条,用于猪肉、鸡肉及鳕鱼中的氯霉素残留的快速检测,可作为现场大量样品快速筛选的

4、有效工具。1材料与方法1.1材料Linomat 5半自动点样仪,瑞士Camag ;酶标测定仪,美国Thermo ;CARY 50Bio 紫外-可见分光光度计,美国Varian ;Milli-Q 纯水发生器,美国Millipore ;硝酸纤维素膜,美国Pierce ,catalogno.88018;Hi-flow plus 型纤维素膜及垫片,美国Millipore ,part no.HF090MC100;吸收垫,美国Millipore ,part no.CFSP223000;氯金酸(HAuC 14·4H 2O ,分析纯,上海化学试剂有限公司;氯霉素标准品、牛血清白蛋白(BSA 、卵清蛋

5、白(OVA 、辣根过氧化物酶和羊抗兔二抗,美国Sigma 公司。胶体金透射电镜扫描由天津师范大学电镜室完成。氯霉素半抗原、抗体、包被抗原(CAP-OVA 、酶标抗原,天津科技大学食品安全研究室自制78。金标抗体储存液:0.3814g 硼酸钠,0.5g BSA 和0.5g 叠氮钠(NaN 3,溶于500mL 二次水;0.01mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS pH 7.4;包被液:pH 9.6碳酸盐缓冲溶液;封闭液:1%BSA-PBS ;洗涤液:PBST (含0.05%Tween-20的PBS ;显色底物溶液:TMB/H 2O 2;终止液:1.25mol/L 硫酸;其它试剂均为国产分析纯试剂。收稿

6、日期:2008-02-27基金项目:国家科技支撑计划资助项目(No.2006BAD05A06作者简介:张燕,女,1970年出生,副教授通讯作者:王硕Vol.9No.1Feb .2009Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology中国食品学报第9卷第1期2009年2月第9卷第1期1.2试验方法1.2.1胶体金及抗体标记物的制备采用柠檬酸三钠还原法9制备胶体金。胶体金溶液自然冷却后,用0.1mol/L K2CO3调节其pH至9.0,在磁力搅拌下,向20mL胶体金溶液中逐滴加入336g抗体,10min后逐滴加入10%的BSA,

7、使溶液中BSA 的终含量为1%,搅拌30min后置于4过夜。1500r/min离心10min,取上清液于4、10000 r/min离心30min,弃上清液。用储存液溶解胶体金至1mL,重复上一步离心步骤,弃上清,胶体金用储存液重悬至原体积的1/10,4保存。1.2.2试纸条的制备以硝酸纤维素膜为固相载体,每条带包被CAP-OVA1g作为检测带(Test zone,T带;每条带包被羊抗兔二抗0.5g作为质控带(Control zone,C带,T带与C带间隔3mm。先将硝酸纤维素膜裁成一定大小(渗滤式0.7cm×1.5cm,侧流式0.5cm×2cm,再置于37恒温箱中固定15m

8、in,经封闭液封闭30min,PBST冲洗3次,37干燥后4保存。1.2.3试纸条的组装6渗滤式形式(见图1:用水将滤纸润湿后紧贴在惰性塑料底板上,再把试纸条正面朝上紧贴在湿润的滤纸上,加样时另取一张干净的滤纸在边缘吸水以促进样液的渗滤。侧流式形式(见图2:将吸水板裁剪成同侧流式膜的宽度,粘贴在膜的上端(与膜有部分重叠,压紧,装入带有干燥剂的密封筒中,于4保存。图1金标记渗滤式分析装置示意图Fig.1Schematic diagram of the analytical device for Flow through immunogold assay图2金标记Lateral flow分析装置示

9、意图Fig.2Schematic diagram of the analytical device for Lateral flow immunogold assay1.2.4竞争反应渗滤式形式:将金标记抗体(经连接储备缓冲液12稀释与含CAP的待测液按13的体积比例(30L+90L混合均匀,取100L混合液加入包被有半抗原的区域。待液体完全渗透过膜上的反应区后,在C带显色的前提下,目视T带的颜色,与空白对照,颜色越浅,代表CAP 含量越高。倒流式形式:将金标记抗体(经连接储备缓冲液12稀释与含CAP的待测液按14的体积比例(20L+80L混合均匀,同时设空白对照(不含CAP,将组装好的试纸条

10、分别浸入相应的混合液中,反应5min后与阴性对照,结果判定同上。1.2.5最低检出限的确定将氯霉素标准品用含5%甲醇的PBST溶液稀释成系列梯度:0.1、0.5、0.8、1、10、50g/L,取上述梯度稀释液与胶体金标记抗体按比例混合后再与包被原进行竞争反应,以能与空白对照有明显色差的最小浓度为检出限。1.2.6样品(猪肉、鸡肉、鳕鱼预处理称取试样2g置于样品瓶中,加入4mL甲醇,旋涡振荡2免疫胶体金法快速检测动物源性食品中氯霉素残留的研究197中国食品学报2009年第1期min,过滤。1.2.7样品基质影响的消除将阴性样品(经液相验证不含CAP处理液用PBST稀释5、10、15、20倍,同时

11、将甲醇用同样的方法稀释作为空白对照,进行竞争反应。基质稀释液与相应空白对照的检测带颜色相同时判断基质影响消除。1.2.8交叉反应选择氯霉素琥珀酸钠、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氨卞西林和磺胺二甲基嘧啶5种药物,分别配成系列浓度,用2种检测方法分别进行竞争反应。1.2.9有效性的验证选择猪肉样品(经液相检测不含氯霉素做氯霉素添加检测试验,样品处理方法见本文1.2.6节,同时采用酶联免疫定量分析法和胶体金试纸条方法进行检测,判断检测结果的一致性。定量方法:在96孔酶标板上用包被液包被抗体(1g/孔,室温孵育过夜。用PBST洗板3次,封闭液封闭1h。弃封闭液后,再用PBST洗板3次。加入不同浓度的CAP标

12、准液或样品稀释液100L/孔和酶标抗原100L/孔,室温孵育1h。洗板后加底物液150L/孔,室温显色30min,加终止液(1.25mol/L浓硫酸50L/孔,终止反应,酶标仪读数,测450nm处吸光值(参考波长为650nm。1.2.10稳定性试验将试纸条和金标记抗体分装后置于37做稳定性试验。在第1、3、5、7天时分别取出,进行竞争反应,观察颜色的变化。2结果与讨论2.1胶体金的制备柠檬酸三钠还原法制备胶体金时,应迅速地一次性加入还原剂,不要逐滴或间断加入,否则易使制得的金颗粒大小不均,形成聚合物,从而使胶体溶液不稳定。本试验中制备的胶体金状态为澄清的红色溶液,表面无漂浮物,说明无聚合物产生

13、。对自然冷却后的胶体金溶液利用紫外-可见光分光光度计在可见光范围(400600nm内进行扫描,得到单一的吸收峰,最大吸收峰波长为522.0 nm。经透射电镜扫描,胶体金颗粒均匀,平均粒径为20nm。2.2检出限的确定通过对半抗原偶联物的包被量、金标记抗体的稀释比例、金标记抗体与待测液混合比例等条件的优化,建立了渗滤式和侧流式2种检测形式。用这2种检测形式对氯霉素标准溶液进行检测,结果表明,当CAP质量浓度低于0.8g/L时,渗滤式检测带的颜色与空白对照无法通过目测区别;大于或等于0.8g/L时可分辨出颜色差别,因此确定渗滤式试纸条对氯霉素的检出限为0.8g/ L。用同样的方法确定侧流式试纸条的

14、检出限为1g/L。随着氯霉素的浓度升高,两种方法检测带的颜色均逐渐变浅,说明在一定范围内该方法可有效检测氯霉素残留量。结果见图3、图4。注:氯霉素质量浓度从左至右分别为:0、0.8、10、50g/L。图3渗滤式试验结果Fig.3Result of the Flow through assay 198第9卷第1期2.3样品基质影响的消除将样品提取液用PBST稀释不同倍数后做竞争试验,当检测带与空白对照颜色相同时视为基质影响消除。经过5次重复试验,确定了猪肉、鸡肉、鳕鱼3种基质的稀释倍数分别为10、10、5倍。本试验样品处理方法简便,3种基质的处理方法相同,只经过甲醇提取、过滤并用PBST简单稀释

15、即可消除基质影响,因此适于现场快速检测。2.4交叉反应选择5种氯霉素结构类似物和常见兽药分别采用2种形式进行抗体结合反应,结果发现氯霉素琥珀酸钠的质量浓度为1g/L时颜色浅于对照,说明该抗体与氯霉素琥珀酸钠有交叉反应。这是因为免疫原合成时是以氯霉素琥珀酸钠为主要反应物,而抗体与氟甲砜霉素、甲砜霉素及其它常用抗菌药物氨卞西林、磺胺二甲基嘧啶无交叉反应,即使其质量浓度为1mg/L时检测带颜色与空白对照无差别。因此除氯霉素琥珀酸钠外,其余药物均不影响2种方法对氯霉素的检测效果。2.5有效性的验证将30例阴性猪肉样品添加不同浓度的氯霉素,采用酶联免疫方法和2种形式的试纸条分别进行检测,并比较结果(见表

16、1。试纸条颜色明显浅于空白对照判断为阳性(+,无法判断记为(±,颜色与空白对照相同判断为阴性(-。试验结果表明,2种试纸条检测形式与定量ELISA的检测结果一致,适用于实际样品中氯霉素的检测。2.6稳定性试验采用加速试验进行稳定性研究。37保存7d 相当于4保存6个月。研究发现,胶体金标记抗体在37保存7d后,2种检测形式的检出限没有变化(图略,说明金标抗体在保存期内稳定性很好。渗滤式试纸条于37干燥保存7d后,检出限仍达0.8g/L(图略。侧流式试纸条于37干燥保存1d后检出限没有变化,但第3天后,颜色变浅,且颜色梯度变差,说明稳定性和有效性不如渗滤式,分析其原因可能是37贮存改变

17、了膜的微观结构,影响了物质在膜上的层析,从而影响检测效果,但如果在4下保存的试纸条微观结构不会改变,侧流式检测也应该有较好的稳定性。2.7渗滤式和侧流式的比较渗滤式方法属于免疫浓缩(immuno-concen-tration反应,金标抗体与待测液的混合物集中在反应区与包被原进行反应,反应物损失小,因此灵敏度高。该方法的缺陷是基质中所有物质均在反应区内,反应受基质的影响大。而侧流式方法属于免疫层析反应,物质在膜上通过毛细管作用向上层析,到达包被区域后与包被原结合。由于层析作注:氯霉素质量浓度从左至右分别为0、1、10、50g/L。图4侧流式试验结果Fig.4Result of the Later

18、al flow assay 添加水平/g·L-1ELISA测定结果/g·L-1渗滤式试纸条测定结果/例侧流式试纸条测定结果/例00-:10-:102016.06+:10-:9±:14032.12+:10+:10表1猪肉样品不同添加水平的ELISA及试纸条测定结果的比较Table1Comparation of the detection results of pork Sample by ELISA and the strips免疫胶体金法快速检测动物源性食品中氯霉素残留的研究199中国食品学报2009年第1期用到达反应区的物质减少,使基质对反应的影响也相应减小,但

19、同时由于膜的非特异吸附,反应物有一定损失,因此灵敏度稍差。侧流式对环境湿度很敏感,试验中发现,包被时若环境湿度大于40%,很容易使条带增宽或不均匀,从而影响结果的判断。参考文献1.陈雪昌,刘琴,钟志,等.酶联免疫法检测虾肉中氯霉素J.浙江海洋学院学报(自然科学版,2005,24(1:7376.2.Allen E H.Review of chromatographic methods for chloramphenicol residues in milk,eggs,and tissues from food-producing animalsJ.J.Assoc Off Anal Chem,19

20、85,68:990999.3.关嵘.应用酶联免疫技术检测动物源性食品中氯霉素残留的研究J.检验检疫科学,2002,12(4:510.4.杨成对,宋莉晖,毛丽哈,等.对虾中氯霉素残留的分析方法研究J.分析化学,2004,32(7:905907.5.Faulk WP,Taylor GM.An immunocolloid method for the electron microscopeJ.Immunochemistry,1971,8:10811083.6.李永勤.以膜为固相载体的免疫胶体金快速试验J.微生物学免疫学进展,2003,31(1:7478.7.Wang S.,Allan R.D.,Sk

21、erritt,et al.Development of a class-specific competitive ELISA for the benzoylphenylureainsecticidesJ.Journal of Agriculture and Food Chemistry,1998,46(8,33303338.8.Wang S.,Zhang J.Yang Z.Y.,et al.Development of two enzyme-linked immunosorbent assays for detection of endo-sulfan residues in agricult

22、ural productsJ.Journal of Agriculture and Food Chemistry,2005,53(19:73777384.9.Frens G.Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensionsJ.Nature Phys.Sci.,1973,241(105:2022.Study on the Colloidal Gold-based Immunoassays for the Rapid Detection of Chloramp

23、henicolResidues in Animal Derived FoodZhang Yan Wang Wei Liu Junwei Wang Shuo(Tianjin Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Faculty of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin Universityof Science and Technology,Tianjin300457Abrstract Objective:Based on the principle of competitive immunoass

24、ay,flow through and lateral flow colloidal gold-labled test strips were established for the rapid on-site detection of chloramphenicol(CAPresidues.Methods:Col-loidal gold was obtained by reducing the gold chloride with sodium citrate,and labeled to an anti-CAP polyclonal anti-body(PAb.CAP was conjugated to ovalbumin(OVAand coated on a nitrocellulose(NCmembrane as the test zone. The analyte in the samples competed with the immobilized CAP conjugate in the test zone for binding the gold col-loidal-labeled antibody.The more analyte present in the sample,the more effectiv