高效毛细管电泳法分析D苯丙氨酸与DN乙酰苯丙氨酸的对映

1、    【摘要】  目的：建立高效毛细管电泳法 (HPCE) 测定不对称合成D苯丙氨酸和DN乙酰苯丙氨酸对映体杂质含量的新方法. 方法：采用HPCE法对苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸对映体的分离条件进行优化，并将该HPCE方法用于样品测定. 结果：在40 mmol/L TrisH3PO4 (pH=2.5)，60 g/L SCD，-15 kV分离电压，20柱温的优化条件下，苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸对映体得到基线分离. 在药物浓度为0.010.20 g/L的考察范围内，浓度和峰面积呈良好线性，L苯丙氨酸和LN乙酰苯丙氨酸的回归方程分别为：Y=1

2、065.42X+31.02（R2=0.9989）和Y=996.02X+34.44（R2=0.9984），其中，Y为校正峰面积A/t，X为浓度（g/L）. 结论：该HPCE方法简单、准确，可用于苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸对映体的手性拆分和对映体杂质含量的测定. 【关键词】  高效毛细管电泳；苯丙氨酸；N乙酰苯丙氨酸；手性分离；对映体杂质0引言近年来，D苯丙氨酸（Dphenylalanin）作为药物或药物中间体已得到了广泛的应用1. 进一步建立D苯丙氨酸及其重要手性中间体DN乙酰苯丙氨酸对映体杂质含量的测定方法对D苯丙氨酸生产质量控制具有重要的意义2-3. 我们利用高效毛细管电泳

3、（HPCE）手性拆分具有简单、高效、低消耗和符合绿色化学要求的基本特性4-5，采用自制磺化环糊精为手性选择剂分别建立同时适合于苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸对映体的最佳分离条件，并测定这两类物质的一系列不同比旋光度样品的对映体杂质含量，以期发展一种简便分离该对映体及其对映体杂质含量测定的毛细管电泳新方法.1材料和方法1.1材料P/ACETM MDQ型毛细管电泳仪系统（Beckman，USA），配有二极管阵列检测器，Beckman System Gold软件；320S pH计（Mettler Toledo Co.）；旋光仪（PerkinElmer 343, USA）. 自制磺化环糊精（sulfated

4、cyclodextrin，SCD）由陕西师范大学化学系李保林教授惠赠；其它试剂均为分析纯. 对照品：光学纯的D苯丙氨酸、外消旋苯丙氨酸（上海化学试剂二厂）；光学纯的DN乙酰苯丙氨酸、外消旋N乙酰苯丙氨酸由本实验室合成（>99.8%  HPLC）.1.2方法1.2.1对照品和样品溶液的制备L苯丙氨酸对照品溶液：精密配制1 g/L的D苯丙氨酸对照品溶液. 精密配置0.8 g/L的外消旋苯丙氨酸溶液（含L苯丙氨酸0.4 g/L）. 从中分别准确吸取0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 5.0, 6.0 mL置于10 mL容量瓶中，分别加入上述2.

5、0 mL D苯丙氨酸对照品溶液，用水定容，则得在大量D苯丙氨酸存在下的含L苯丙氨酸0.0050.24 g/L的一系列对照品溶液；L苯丙氨酸样品溶液：精密称取不同光学纯度的D苯丙氨酸、DN乙酰苯丙氨酸分别配置成10.0 g/L的样品母液，测定时根据标准曲线线性范围适当稀释. LN乙酰苯丙氨酸溶液的配制同L苯丙氨酸.1.2.2电泳条件和实验方法未涂层石英毛细管柱（48.7 cm×75 m, id，有效长度38.5 cm，Beckman公司）. TrisH3PO4缓冲溶液中加入适量的SCD作为背景电解质； 工作电压-5-25  kV， 柱温1520；0.5 psi压力进

6、样5 s；二极管阵列检测；所用溶液均经0.45 m纤维素酯膜过滤.统计学处理：采用线性回归模型对浓度与峰面积进行线性关系分析.2结果2.1手性选择剂浓度的选择考察在3080 g/L浓度范围的SCD对苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸对映体分离的影响，结果60 g/L为SCD的理想浓度（图1）.2.2背景缓冲液浓度与pH值对分离效果的影响40 mmol/L Tris浓度为同时适合于苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸两对对映体的理想分离条件(图2). 通过对pH 1.54.0范围内苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸对映体分离度的考察表明，苯丙氨酸对映体在pH 2.03.0的范围内都有良好分离，而只有在pH 2.5时才可使N乙酰

7、苯丙氨酸对映体达到基线分离，所以选择pH 2.5为分离酸度.2.3毛细管温度对分离的影响在1530的范围内， 温度升高一方面使迁移时间缩短， 但同时也降低了对映体的分离度. 综合考虑分离度与分析时间， 本实验选用20作为分离温度， 在此温度下， 两对映体均可得到较好的分离结果与相对短的迁移时间.2.4样品对映体杂质含量的测定线性关系考察: 在0.010.20 g/L的浓度范围内， 按优化的电泳条件分别对L苯丙氨酸或LN乙酰苯丙氨酸进行线性关系分析， L苯丙氨酸的回归方程为： Y=1065.42X+31.02 （R2=0.9989）； LN乙酰苯丙氨酸的回归方程为： Y=996.02X+34.4

8、4 （R2=0.9984）， 其中， Y为校正峰面积（A/t）， X为浓度（g/L）. 回收率与最低检测限考察:  精密量取L苯丙氨酸或LN乙酰苯丙氨酸0.05, 0.10, 0.15 g/L的对照品溶液各4.0 mL（n=5）， 按上述电泳条件分析并计算回收率（%）. 结果L苯丙氨酸的回收率在99.1102.5 (n=5)； LN乙酰苯丙氨酸的回收率在98.1102.9. 同时， 按上述电泳条件电泳， 以信噪比S/N=3测定L苯丙氨酸和LN乙酰苯丙氨酸的最低检测限（LOD）， 得到L苯丙氨酸的LOD为2.5 g/mL, LN乙酰苯丙氨酸的LOD为3.0 g/mL. 样品测

9、定: 对一系列具有不同比旋光度的D苯丙氨酸与DN乙酰苯丙氨酸合成样品进行了对映体杂质含量的测定， 结果杂质L苯丙氨酸的含量在0.25%9.3%之间， 杂质LN乙酰苯丙氨酸的含量在0.20%8.2%之间(图3).3讨论随SCD手性选择剂浓度的提高，苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸对映体的分离度Rs均增大，当手性选择剂浓度提高到60 g/L时，苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸两对对映体的Rs值达到最大. 而进一步提高手性选择剂的浓度反而导致了分离度的下降，这和Williams等6提出的分离模型相一致，即存在一个最佳手性选择剂浓度，浓度过高或过低，都会导致分离度的下降. 同时，当SCD浓度超过70 g/L时，电流不

10、稳，基线漂移，这可能是由于SCD带负电，浓度较大时，受电场力较大，电泳电流增大过多而导致焦耳热较大所致. 而在60 g/L时，N乙酰苯丙氨酸和苯丙氨酸对映体的分离度分别达到1.74和3.22，所以选择60 g/L为SCD的理想浓度.缓冲溶液的浓度影响溶液的粘度系数、溶质的扩散系数等，最终影响分析物的分辨率和迁移时间. 由图2可见，苯丙氨酸对映体在3045 mmol/L的Tris浓度范围内均得到良好的分离（Rs>2），但只有在40 mmol/L才可使N乙酰苯丙氨酸达到基线分离（Rs=1.72）. 同时，随Tris浓度的增加，两对对映体的迁移时间也均增加，所以本实验选择40 mmol/L T

11、ris浓度为同时适合于苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸两对对映体的理想分离条件.本文建立了同时适合于苯丙氨酸和N乙酰苯丙氨酸对映体的HPCE分离条件，并用于该产品的对映体杂质含量的分析，对于这两类手性药物或药物中间体合成中光学纯度控制具有重要意义.【参考文献】  1Pogson CI, Knowles RG, Salter M. The control of aromatic amino acid catabolism and its relationship to neurotransmitter amine synthesis J. Crit Rev Neurobiol, 19

12、89, 5(1): 29-64.2Miyazaki T, Sugawara M, Danjo H, et al. Dihydroboronium derivatives of (S,S)1,2bis(tbutylmethylphosphino) ethane as convenient chiral ligand precursors J. Tetrahedron Lett, 2004, 45: 9341-9344.3Mikus P, Kaniansky D. Capillary zone electrophoresis monitoring of enantioselective hydro

13、genation of Nacyldehydroamino acids J. J Sep Sci, 2002, 25(14): 872-876.4Zhao Y, Yang XB, Jiang R, et al. Analysis of optical purity and impurity of synthetic Dphenylalanine products using sulphated cyclodextrin as chiral selector by the reversedpolarity capillary electrophoresis J. Chirality, 2006, 18 (2):84-90.5Fanali S. Stereoselective analysis of pharmaceutical compounds in biological fluids using capillary electrophoresisJ. J Chromatogr A, 1996, 73