分光光度计2009-9

1、Basic UV-Vis Theory and Applications分光光度计的原理与应用一、基本原理一、基本原理o 利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光光度法或分光分光光度技术，使用的仪器称为分光光度计。光度技术，使用的仪器称为分光光度计。o 分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中的紫外其中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学

2、研究可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。因此我们重点讨工作中必不可少的基本手段之一。因此我们重点讨论紫外论紫外/可见分光光度法的基本原理、仪器构造及可见分光光度法的基本原理、仪器构造及其在生化领域中的应用等。其在生化领域中的应用等。电磁辐射的波长电磁波波长的范围o Region Wavelength (nm)o Far ultraviolet 10-200o Near ultraviolet 200-380o Visible 380-780o Near infrared 780-3000o Middle infrared 3000-30,000o Far infrar

3、ed 3104-3105o Microwave 3105-1109Relationship between light absorption and color电子跃迁类型与紫外吸收波长(nm)关系o 电子跃迁类型 例子 紫外吸收波长范围o * CH 100150 nm o *(非共轭) CO 200 nm o *(共轭) CC 200300 nm o n* CO 300 nmExamples of transitions and resulting maxo*跃迁：此类跃迁所需能量较小，跃迁：此类跃迁所需能量较小，吸收波长在紫外区的吸收波长在紫外区的200300 nm，不饱和烃、共轭烯烃及芳

4、香烃均可发不饱和烃、共轭烯烃及芳香烃均可发生这类跃迁，氨基酸、蛋白质与核酸生这类跃迁，氨基酸、蛋白质与核酸均含有大量共轭双键，因而均含有大量共轭双键，因而200300 nm的紫外吸收测定，在生化实的紫外吸收测定，在生化实验技术中有极广泛的用途。验技术中有极广泛的用途。Commonly used solvents and their cut-off wavelengths不同溶剂对酚紫外检测的影响不同溶剂对酚紫外检测的影响o 若逐渐改变照射某物质的入射光的波长，并若逐渐改变照射某物质的入射光的波长，并测定物质对各种波长光的吸收程度（吸光度测定物质对各种波长光的吸收程度（吸光度“A”或光密度或光密

5、度“O.D”）或透射程度（透光）或透射程度（透光度度“T”），以波长），以波长作横坐标，作横坐标，“A”或或“T”为纵座标，画出连续的为纵座标，画出连续的“A”或或“T”曲线，即为该物质的吸收光谱曲线。曲线，即为该物质的吸收光谱曲线。吸收峰的命名o 曲线上“A”处称最大吸收峰，它所对应的波长称最大吸收波长，以max表示。o 曲线上“B”处有一谷，称最小吸收，它所对应的波长，所对应的波长，称最小吸收波长，以min 表示。o 曲线上在最大吸收峰旁边有一小峰“C”，称肩峰。o 在吸收曲线的波长最短的一端，曲线上“D”处，吸收相当强，但不成峰形，此处称为末端吸收。o max是化合物中电子能级跃迁时吸收

6、的特是化合物中电子能级跃迁时吸收的特征波长，不同物质有不同的最大吸收峰，所征波长，不同物质有不同的最大吸收峰，所以它对鉴定化合物极为重要。吸收光谱中，以它对鉴定化合物极为重要。吸收光谱中，max、min、肩峰以及整个吸收光谱的肩峰以及整个吸收光谱的形状决定于物质的性质，其特征随物质的结形状决定于物质的性质，其特征随物质的结构而异，所以是物质定性的依据。构而异，所以是物质定性的依据。o 测定某物质的紫外吸收光谱的曲线，可与已测定某物质的紫外吸收光谱的曲线，可与已知标准的紫外光谱图相对照，对照时须注意知标准的紫外光谱图相对照，对照时须注意测定的条件，如溶剂、浓度等。测定的条件，如溶剂、浓度等。o

7、由于化合物紫外吸收峰较少，而且峰形都很宽，不由于化合物紫外吸收峰较少，而且峰形都很宽，不象红外光谱有许多指纹峰，所以在用紫外吸收光谱象红外光谱有许多指纹峰，所以在用紫外吸收光谱进行化合物定性鉴定时，应注意：化合物相同，其进行化合物定性鉴定时，应注意：化合物相同，其紫外光谱应完全相同；但是紫外光谱相同不一定化紫外光谱应完全相同；但是紫外光谱相同不一定化合物就相同，可能仅是存在某些相同的发色团或基合物就相同，可能仅是存在某些相同的发色团或基团，因此在鉴定时应与红外光谱相结合。团，因此在鉴定时应与红外光谱相结合。o 由于电子跃迁的同时也引起分子的转动和振动光谱，由于电子跃迁的同时也引起分子的转动和振

8、动光谱，要把电子跃迁和分子振动、转动的跃迁完全分开是要把电子跃迁和分子振动、转动的跃迁完全分开是不可能的，因此我们常见的紫外吸收光谱是由一个不可能的，因此我们常见的紫外吸收光谱是由一个或几个宽的吸收谱带所组成。或几个宽的吸收谱带所组成。紫外光谱中常用的术语发色团、助色团、增色效应和减色效应。发色团、助色团、增色效应和减色效应。o 发色团：凡是与饱和碳氢化合物连接能引起发色团：凡是与饱和碳氢化合物连接能引起n*、*、 n* 等电子跃迁的基团称为发色团。等电子跃迁的基团称为发色团。例如：例如：CC、CO等。等。o 助色团：助色团是一些具有非共价键的基团（如助色团：助色团是一些具有非共价键的基团（如

9、OH、NH2、SH等）。这些基团在波长等）。这些基团在波长200 nm处没有吸收，当它与发色团相连接时，使发色处没有吸收，当它与发色团相连接时，使发色团的吸收带向长波移动，称为团的吸收带向长波移动，称为红移红移（或浅色效应），（或浅色效应），红移的同时吸收带的强度增加。若助色团与发色团红移的同时吸收带的强度增加。若助色团与发色团相连接，产生相连接，产生 n* 跃迁，使吸收波长向短波跃迁，使吸收波长向短波移动，称为移动，称为兰移兰移（或深色效应）。（或深色效应）。增色效应（增色效应（hyperchromic effect）o 核酸变性或降解，使得核酸变性或降解，使得DNA或或RNA溶液对溶液对紫

10、外光的吸收明显增加，即紫外光的吸收明显增加，即 值（吸光系数值（吸光系数或称消光系数）显著升高，此现象称为增色或称消光系数）显著升高，此现象称为增色效应。此效应是由于碱基之间电子相互作用效应。此效应是由于碱基之间电子相互作用的改变所致，通常在的改变所致，通常在260nm处测量。处测量。减色效应（减色效应（hypochromic effect）o 在一定的条件下，变性的核酸又可以复性，在一定的条件下，变性的核酸又可以复性，此时此时值又明显减少，回复到原来的核酸分值又明显减少，回复到原来的核酸分子子值较低的水平，即此时值较低的水平，即此时DNA或或RNA溶溶液的紫外光吸收显著降低，此现象称为减色液

11、的紫外光吸收显著降低，此现象称为减色效应，此效应也是由于碱基之间电子相互作效应，此效应也是由于碱基之间电子相互作用的变化所引起的，通常在用的变化所引起的，通常在260nm条件下条件下测量。测量。光吸收定律光吸收定律o 朗伯朗伯比尔（比尔（Lambertbeer）光吸收定律：）光吸收定律： A-lgTb co A吸光度，又称光密度吸光度，又称光密度“O.D”。o T透光度，透光度， TI / I。，。， I。为照射到吸收为照射到吸收池上的光强，池上的光强，I为透过吸收池的光强。为透过吸收池的光强。o 摩尔吸光系数（摩尔吸光系数（Lmol-1cm-1）。）。o b样品光程（样品光程（cm），通常使

12、用），通常使用1.0cm 的吸收池，的吸收池，b=1cm。o C样品浓度（样品浓度（mol/L）。）。吸光度吸光度A与物质的吸光系数与物质的吸光系数“”和物质的浓度和物质的浓度“C”成正比。成正比。检测计算溶液的摩尔浓度o 例如：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池测定 260nm处的吸光度为0.650，用同一吸收池测定纯溶剂的吸光度为0.070，计算尿嘧啶溶液的摩尔浓度，已知其摩尔吸光系数 = 8.2103 M-1cm-1（Mmol / L)。o A bC A（溶剂加样品的吸光度）（溶剂的吸光度）o A0.6500.0700.580 b1cmo C=7.110-5 mol / L 二、分光光度

13、计的组成和构造 1. 组成：各种型号的紫外组成：各种型号的紫外/可见分光度计，不可见分光度计，不论是何种型式，基本上都由五部分组成：论是何种型式，基本上都由五部分组成：o 光源：钨灯和氘光源：钨灯和氘(dao)灯灯o 单色器（包括产生平行光和把光引向检测器单色器（包括产生平行光和把光引向检测器的光学系统）；的光学系统）；o 样品室；样品室；o 接收检测放大系统；接收检测放大系统；o 显示或记录器。显示或记录器。 光源光源o 理想光源的条件是：能提供连续的辐射；光强度理想光源的条件是：能提供连续的辐射；光强度足够大；在整个光谱区内光谱强度不随波长有明显足够大；在整个光谱区内光谱强度不随波长有明显

14、变化；光谱范围宽；使用寿命长，价格低。变化；光谱范围宽；使用寿命长，价格低。o 用于可见光和近红外光区的光源是钨灯，现在最常用用于可见光和近红外光区的光源是钨灯，现在最常用的是卤钨灯（的是卤钨灯（Halogen lamp），即石英钨灯泡中），即石英钨灯泡中充以卤素，以提高钨灯的寿命。适用波长范围是充以卤素，以提高钨灯的寿命。适用波长范围是3201100nm。由于能量输出的波动为电压波动。由于能量输出的波动为电压波动的四次方倍，因此电源电压必须稳定。的四次方倍，因此电源电压必须稳定。o 用于紫外光区的是氘灯（用于紫外光区的是氘灯（Deuterium lamp），适），适用波长范围是用波长范围是1

15、95400nm，由于氘灯寿命有限，由于氘灯寿命有限，国产氘灯寿命仅五百小时左右，要注意节约灯时。国产氘灯寿命仅五百小时左右，要注意节约灯时。 单色器单色器o 单色器是分光光度计的心脏部分，它的作用是把来自光源单色器是分光光度计的心脏部分，它的作用是把来自光源的混合光分解为单色光并能随意改变波长。它的主要组成的混合光分解为单色光并能随意改变波长。它的主要组成部件和作用是：入射狭缝部件和作用是：入射狭缝限制杂散光进入。色散限制杂散光进入。色散元件元件即棱镜或光栅，是核心部件，可将混合光分解为即棱镜或光栅，是核心部件，可将混合光分解为单色光。准直镜单色光。准直镜把来自入射狭缝的光束转化为平等把来自入

16、射狭缝的光束转化为平等光，并把来自色散元件的平等光聚焦于出射狭缝上。出光，并把来自色散元件的平等光聚焦于出射狭缝上。出射狭缝射狭缝只让额定波长的光射出单色器只让额定波长的光射出单色器o 转动棱镜或光栅的波长盘，可以改变单色器出射光束的波转动棱镜或光栅的波长盘，可以改变单色器出射光束的波长；调节出入射狭缝隙的宽度，可以改变出射光束的带宽长；调节出入射狭缝隙的宽度，可以改变出射光束的带宽和单色光的纯度。和单色光的纯度。o 光栅：光栅有透射光栅和反射光栅，实际应用的都是反射光栅：光栅有透射光栅和反射光栅，实际应用的都是反射光栅，它又可分为平面反射光栅（即通称的反射光栅或闪光栅，它又可分为平面反射光栅

17、（即通称的反射光栅或闪烁光栅）和凹面反射光栅两类，凹面反射光栅可以起色散烁光栅）和凹面反射光栅两类，凹面反射光栅可以起色散元件和准直镜两个作用，使色散后的光束聚焦于出射狭缝，元件和准直镜两个作用，使色散后的光束聚焦于出射狭缝，得到锐线光谱。得到锐线光谱。狭缝、光谱频带宽度和分辨率狭缝、光谱频带宽度和分辨率o 出射狭缝的宽度通常有两种表示方法：一为出射狭缝的宽度通常有两种表示方法：一为狭缝的实际宽度，以毫米（狭缝的实际宽度，以毫米（mm）表示，另）表示，另一种为光谱频带宽度，即指由出射狭缝射出一种为光谱频带宽度，即指由出射狭缝射出光束的光谱宽度，以毫微米光束的光谱宽度，以毫微米nm表示。例如，表

18、示。例如，出射狭缝的宽度是出射狭缝的宽度是6nm，并不是说出射狭，并不是说出射狭缝的宽度是缝的宽度是6nm，而是指由此狭缝射出的，而是指由此狭缝射出的光具有光具有6nm的光谱带宽。的光谱带宽。o 纯粹的单色光只是一种理想情况，分光光度计所能纯粹的单色光只是一种理想情况，分光光度计所能得到的得到的“单色光单色光”，实际上只是具有一定波长范围，实际上只是具有一定波长范围的谱带，狭缝越宽，所包括的波长范围也愈宽。的谱带，狭缝越宽，所包括的波长范围也愈宽。 对单色光纯度来说，狭缝是愈窄愈好，但光的强度对单色光纯度来说，狭缝是愈窄愈好，但光的强度也就越弱，因此狭缝不能无限制地小，狭缝的最小也就越弱，因此

19、狭缝不能无限制地小，狭缝的最小宽度取决于检测器能准确地进行测量的最小光能量。宽度取决于检测器能准确地进行测量的最小光能量。目前达到的最小宽度为目前达到的最小宽度为0.1nm。o 由于光栅分光其色散是线性的，所以只用一种狭缝由于光栅分光其色散是线性的，所以只用一种狭缝宽度对各种波长的光的测量，其分辨率都相同，即宽度对各种波长的光的测量，其分辨率都相同，即狭缝宽度不必经常调节。只要光强能达到要求，应狭缝宽度不必经常调节。只要光强能达到要求，应使用尽可能小的狭缝宽度，以提高分辨率。使用尽可能小的狭缝宽度，以提高分辨率。 样品室样品室o 包括池架、吸收池（即比色杯）以及各种可更换的包括池架、吸收池（即

20、比色杯）以及各种可更换的附件。池架有普通池架和恒温池架，恒温池架有水附件。池架有普通池架和恒温池架，恒温池架有水恒温池架和电恒温池架。水恒温池架需用循环水恒恒温池架和电恒温池架。水恒温池架需用循环水恒温装置打入循环水保持池架恒温，控温精度为温装置打入循环水保持池架恒温，控温精度为 0.1，电恒温池架十分昂贵，控温精度可达，电恒温池架十分昂贵，控温精度可达 0.05。o 吸收池有光学玻璃杯和石英玻璃杯两种。光学玻璃吸收池有光学玻璃杯和石英玻璃杯两种。光学玻璃杯因为普通光学玻璃吸收紫外光，因此只能用于可杯因为普通光学玻璃吸收紫外光，因此只能用于可见光，适用波长范围是见光，适用波长范围是400nm2

21、000nm。石。石英玻璃杯可透过紫外光、可见光和红外光，英玻璃杯可透过紫外光、可见光和红外光， 是最是最常使用的吸收池，使用波长范围是常使用的吸收池，使用波长范围是180nm3000nm。 吸收池使用注意事项吸收池使用注意事项o 要彻底清洗，尤其是盛过蛋白质等溶液，干后形成一层要彻底清洗，尤其是盛过蛋白质等溶液，干后形成一层膜，不易洗去，通常杯子不用时可放在膜，不易洗去，通常杯子不用时可放在 1洗洁净液中洗洁净液中浸泡，去污效果好，使用时用水冲洗干净，要求杯壁不浸泡，去污效果好，使用时用水冲洗干净，要求杯壁不挂水珠，还可用绸布丝线或软塑料制作小刷子清洗。挂水珠，还可用绸布丝线或软塑料制作小刷子

22、清洗。o 严禁用手指触摸透光面，因指纹不易洗净。严禁用硬纸严禁用手指触摸透光面，因指纹不易洗净。严禁用硬纸和布擦拭透光面，只能使用镜头纸和绸布。和布擦拭透光面，只能使用镜头纸和绸布。o 严禁加热烘烤。急用干的杯子时，可用酒精荡洗后用冷严禁加热烘烤。急用干的杯子时，可用酒精荡洗后用冷风吹干。决不可用超声波清洗器清洗。风吹干。决不可用超声波清洗器清洗。o 吸收池的校正：要固定参比杯和样品杯，可在杯的毛玻吸收池的校正：要固定参比杯和样品杯，可在杯的毛玻璃面上写上记号。用盛有参比液的参比杯和样品杯测定璃面上写上记号。用盛有参比液的参比杯和样品杯测定吸光度吸光度“A0”，样品杯换上样品液后测定的吸光度为

23、，样品杯换上样品液后测定的吸光度为“A1”，则校正后的实际吸光度，则校正后的实际吸光度A为：为：o A= A1A0 检测器检测器o 检测器是一种光电转换设备，即把光强度以电讯号显示出来，常用的检测器有光电管，光电倍增管和光电二极管等三种。o 光电二极管：原理是硅二极管受紫外近红外辐射照射时，其导电性增强的大小与光强成正比。近年来分光光度计使用光电二极管作检测器在增加，虽然其灵敏度还赶不上光电倍增管，但它的稳定性更好，使用寿命更长，价格便宜，因而许多著名品牌的高档分光光度计都在使用它作检测器。尤其值得注意的是由于计算机技术的飞速发展，使用光电二极管的二极管阵列分光光度计有了很大发展，二极管数目已

24、达1024个，明显提高了分辨率。o 这种新型分光光度计的特点是“后分光”，即氘灯发射的光经透镜聚焦后穿过样品吸收池，经全息光栅色散后被二极管阵列的各个二极管接收，信号由计算机进行处理和存储，因而扫描速度极快，约10ms就可完成全波段扫描，绘出吸光度、波长和时间的三维立体色谱图，可以最方便快速地得到任一波长的吸收数据，它最适宜用于动力学测定，也是高效液相色谱仪最理想的检测器。 显示输出装置显示输出装置低档分光光度计现在已都使用数字显示，有的低档分光光度计现在已都使用数字显示，有的还连有打印机。现代高性能分光光度计均可还连有打印机。现代高性能分光光度计均可以连接微机，而且有的主机还使用带液晶或以连

25、接微机，而且有的主机还使用带液晶或CRT荧屏显示的微处理机和打印绘图机。荧屏显示的微处理机和打印绘图机。有的还带有标准软驱，存取数据更加方便（例有的还带有标准软驱，存取数据更加方便（例如如SPECORD 200）。）。分光光度计光路原理图光源切换镜石英卤素灯氘灯滤色盘场镜入口球面反光镜基准转换镜旋转镜电机螺环镜样品室凹形全息光栅出口分光光度法在生化实验中的应用o 分光光度计除用于常规的吸光度测定和吸收分光光度计除用于常规的吸光度测定和吸收光谱的扫描外，常用的分光光度法还有导数光谱的扫描外，常用的分光光度法还有导数分光光度法、催化动力学分光光度法和差示分光光度法、催化动力学分光光度法和差示分光光

26、度法等。分光光度法等。o 在生化实验中主要用于氨基酸含量的测定、在生化实验中主要用于氨基酸含量的测定、蛋白质含量的测定、核酸的测定、酶活力测蛋白质含量的测定、核酸的测定、酶活力测定、生物大分子的鉴定和酶催化反应动力学定、生物大分子的鉴定和酶催化反应动力学的研究等。的研究等。o 相对浓度、分子构象、反应过程记录等等。相对浓度、分子构象、反应过程记录等等。NAD 和和 NADH吸收光谱的对比吸收光谱的对比三、三、Helios仪器特点仪器特点o 采用全息母光栅（不是复制光栅），采用全息母光栅（不是复制光栅）， 可获得优异可获得优异的光学性能和耐久性，即使在高吸光度的光学性能和耐久性，即使在高吸光度3

27、A下也能下也能保持线性。保持线性。o 采用步进马达单色器，配合采用步进马达单色器，配合Hatten Modulator 调制器，使得无论是高速扫描还是低速扫描，其扫调制器，使得无论是高速扫描还是低速扫描，其扫描曲线完全重合（没有峰值）。描曲线完全重合（没有峰值）。o 真正的双光束，光束能量比为样品真正的双光束，光束能量比为样品/参比参比=80/20，可获得良好的信噪比。可获得良好的信噪比。o 标准软盘，存取方便，方便计算机的应用。标准软盘，存取方便，方便计算机的应用。主机功能o SCAN：测定吸收值和吸收峰o FIXED：在一固定波长下的吸收值o QUANT：浓度测定（以一标准作参照）o RATE：一定时间范围内吸收值的变化曲线。o 存盘配件功能配件功能n 连续进样分析：加流动池配件连续进样分析：加流动池配件（SUPPERSIPPER）n 打印：配打印机打印：配打印机n 计算机控制：配计算机计算机控制：配计算机n 核酸解链分析：配核酸解链配件（水浴核酸解链分析：配核酸解链配件（水浴+温控）温控）n 酶动力学：温控装置。酶动力学：温控装置。操作步骤o开机预热：电源在机器后面。开机预热：电源在机器后面。o在在HOME 主页上选择功能，用箭头（机子右下角）主页上选择功能，用箭头（机子右下角）选择，确定后按选择，确定后按ENTER，再进一步用箭头，