不同浓度rhEPO对神经干细胞体外培养增殖的影响

1、不同浓度rhEPO对神经干细胞体外培养增殖的影响         11-03-29 14:51:00     编辑：studa20                 作者：胡萌，吕刚，梅晰凡，张世民【摘要】  目的 观察不同浓度rhEPO对神经干细胞体外培养增殖的影响，探讨rhEPO联合神经干细胞移植治疗脊髓损

2、伤修复的影响。方法 用不同浓度(5、50、500 U/mL)rhEPO干预从新生SD大鼠(出生24 h以内)取材来的神经干细胞，分别检测每组神经干细胞克隆形成率;在不同时间分别用MTT法检测细胞增殖率;神经干细胞分化的免疫细胞化学染色及计数。结果 添加rhEPO各实验组细胞增殖较快最终神经球的数量多于对照组,以50 U/mL rhEPO组作用显著;添加rhEPO各实验组的细胞生长曲线均高于对照组,尤其是50 U/mL rhEPO组显著高于对照组;NSE和GFAP免疫细胞化学染色和计数结果显示,50 U/mL rhEPO组中NSE免疫阳性细胞明显多于对照组(P<0.01)。结论 rhEPO

3、对神经干细胞体外培养增殖有促进作用，尤以适中浓度(50 U/mL)作用更加明显。 【关键词】  神经干细胞;rhEPO;体外培养;增殖            Abstract: Objective To observe the effect which multiplies in vitro raise to the nerve stem cell of different density rhEPO, and to discuss the influence of

4、 rhEPO, associated with nerve stem cell transplant, in curing spinal cord damage repair. Methods The present research firstly intervened the nerve stem cell, obtained from the newborn SD big mouse (born within 24hs), with different density rhEPO (5, 50, 500 U/mL). Then, a distinctive examination of

5、the rate of clone formation in each groups nerve stem cells was conducted. Afterwards, MTT method was used to examine the cell reproducibility in different times and nerve stem cell differentiations immunocytochemistry dyeing and counting. Results The cell multiplication in experimental groups which

6、 had added the EPO was quicker and the quantity of final nerve balls was larger than that in the control group, which was remarkable in 50 U/mLEPO group. The cell growth curve in experimental groups which had added the rhEPO was higher than that in the control group, which was also remarkable in 50

7、U/mL EPO group. The NSE and GFAP immunocytochemistry dyeing and the counting results showed that the NSE immunity masculine cells in the 50 U/mL EPO group were obviously more than that in the control group (P<0.01). Conclusions rhEPO has the positive effect on the nerve stem cell in vitro raise m

8、ultiplication, which is more obvious with the moderate density (50 U/mL).Key words:nerve stem cell; rhEPO; in vitro raise; multiplication神经干细胞(nerve stem cell,NSCs)是一种具有复制能力和多向分化潜能的原始细胞，在中枢神经系统损伤的修复研究中逐渐引起医学界的关注。近年来的研究发现，神经干细胞不仅存在于 胚胎脑组织,而且已发育成熟的 内也存在神经干细胞1。正常情况下这些NSCs处于“静止”或“休眠”状态，在特定因素的作用下，例如损伤或刺激

9、，其分裂、分化的潜能就被激活，从而出现增殖现象。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对离体神经干细胞具有一定的增殖效应，但其作用有限2。因此，如何更有效的促进NSCs的增殖是推动其在治疗过程中的重要方法。本实验对重组人促红细胞生成素(rhEPO)和bFGF联合应用促进NSCs的体外增殖效应进行初步探讨。1 材料与方法1.1 主要材料新生SD大鼠(出生24h以内)、DMEM/F12培养基、无血清培养添加剂B27(美国Gibco)、bFGF(北京双鹭生物制品公司)、EGF(premega公司)、胰蛋白酶、谷氨酰胺(Sigma)， MTT(

10、噻唑兰)、DMSO(二甲基亚砜)，及其他相关试剂。1.2 方法1.2.1 神经干细胞的原代培养新生SD大鼠经75%酒精消毒，无菌条件下将前脑完整取出，借助显微镜在视交叉平面和海马平面各做一道冠状切口，留取自视交叉至海马约2 mm厚的脑块。将留取的脑块冠状面朝上放置，然后在侧脑室外侧做两道矢状切口，并且在胼胝体上方做一水平切口，留取中间围绕侧脑室前角的脑块。此部位包含侧脑室前角室下带(subventricular zone，SVZ)，富含神经干细胞。去除软脑膜和脉络丛组织。将脑组织转移到另一培养皿，用剪刀反复剪切至约1 mm3大小组织块，加入DMEM/F12基础培养基23 mL,用吸管反复吹打，

11、制成细胞悬液。将细胞悬液用200 目铜网过滤，去除残留未分散组织，将滤液移入无菌10 mL离心管。离心机将过滤的细胞悬液以1 000 r/min离心10 min，以便收集细胞。吸管小心吸除上清液体，将沉淀的细胞重悬于2 mL含B27和20 ng/mL bFGF，20 ng/mL EGF的DMEM/F12培养基中，计数板计数后以25×105个细胞/mL接种于25 cm3 培养瓶。置37 oC，5%CO2培养箱内培养。培养45 d后，将含细胞的培养液转移至离心管中，1 000 r/min离心10 min,收集细胞。同样方法小心吸除上清液体，用相同培养液重悬细胞后，接种于更换的培养瓶中，继

12、续培养。每57天换液1次。培养2周左右时见神经干细胞克隆形成，34 周见大量神经干细胞球。以后用机械法分散神经球方法进行传代培养。1.2.2 神经干细胞的传代培养将细胞移入无菌10 mL离心管，以1 000 r/min转速离心10 min，收集细胞。吸除上清液体，向沉淀中加入3倍体积的0.25%胰蛋白酶/EDTA(1：1)消化液，37 水浴5 min。用吸管轻轻吹打成单细胞悬液(此步骤时间不超过5 min)。加入1/10体积的血清终止消化。以25×105个细胞/mL细胞浓度继续培养，培养基成分同上。1.3 实验分组取第3代神经干细胞制备单细胞悬液,分别接种于含rhEPO 5、50、5

13、00 U/mL的无血清培养基中,同时设不含rhEP0的对照组，其中实验组、对照组无血清培养基含bFGF浓度均为20 ng/mL。将各组神经干细胞悬液置于5%CO2、37 培养箱内培养。每组均设复孔,实验重复3次。1.4 检测指标1.4.1 检测神经干细胞克隆形成率将各组细胞作梯度倍数稀释接种于25 cm3培养皿中静置培养。细胞培养7 d时,取对照组和各实验组培养皿放置在一张带网格的透明胶片上,在倒置显微镜下计数克隆数,计算公式如下:克隆形成率(%)=单位面积克隆数/单位面积接种细胞数×100。1.4.2 MTT法检测细胞的活性将各组细胞以每孔大约1.0×105个细胞接种于96孔培养