第四微生物反应动力学(制药工程)

1、第四章 细胞反应动力学细胞反应动力学4.1 微生物反应过程的质量和能量衡算4.1.1 微生物反应过程的质量衡算微生物反应中参与反应的培养基成分多，反应途径复杂。如果把微生物反应看成是生成多种产物的复合反应：碳源+氧+氮源=菌体+有机产物+二氧化碳+水CHmOn+aO2+bNH3cCHxOyNz+dCHuOvNw+eCO2+fH2O呼吸商：呼吸商：细胞生长过程中放出的CO2与消耗的O2的摩尔比消耗速率产生速率2222/OCOOOCOYRQ22CO式中: CO2 为一定时间内细胞生长放出的CO2量(mol、Kmol) ；4.1.2 微生物反应过程的得率系数n得率系数是对碳源等物质生成细胞或其他产物

2、的潜力进行定量评价的重要参数。消耗1克基质生成细胞的克数称为细胞得率或生长得率。SXSXmmY消耗基质的质量生成细胞的质量/SXSXrrdtSddtdXSddXY/ /n对底物的细胞得率系数n对底物的产物得率系数SSPYmmP/消耗基质的质量生成代谢产物的质量n与碳元素相关的得率系数YC：当基质为碳源，一部分被同化为细胞组成成分，其余部分被异化分解为CO2和代谢产物。SXSXSSXXCYmmY/)(基质含碳量消耗基质的质量细胞含碳量生成细胞的质量X XC C和和S SC C-单位质量细胞的含碳量和单位质量基质的含碳量单位质量细胞的含碳量和单位质量基质的含碳量n与氧相关的得率系数YO：生成细胞质

3、量与消耗氧的比值。消耗氧的质量生成细胞的质量OY举例：C6H12O6+aO2+bNH3cC4.4OH7.3N0.86O1.2+dH2O+eCO2已知：葡萄糖中的碳2/3转化为细胞中的碳1.1.计算计算c c值值2.2.计算计算e e值值3.3.根据原子的平衡关系计算根据原子的平衡关系计算b,d,ab,d,a值值4.4.求求Y YX/SX/S5.5.求求Y YX/OX/O4.2 细胞生长的非结构动力学4.2.1 细胞生长动力学描述方法（1）微生物反应过程细胞群体 细菌群体的复杂性细菌群体的复杂性：通常1mL培养液中含有107108个细胞，每个细胞都经历生长、成熟、衰亡的过程，同时伴有退化、变异多

4、多 相：相：体系中有液相、固相、气相，性质不同，相内、相间有反应、传质多组份：多组份：细胞组成复杂,蛋白质、脂肪、糖、核酸、维生素、无机盐、水等,培养液中的营养物，代谢产物非线性：非线性：生化反应过程复杂,不能用线性方程描述（2）细菌群体描述的简化微生物反应动力学是对细菌群体而言，而不是对单一细胞不考虑细胞之间的差异，性质上取平均值。此模型为确定论模型；考虑细胞之间的差异为概率论模型把细胞视为单组成，忽略环境变化对菌体组成的影响，所建立的模型为非结构性模型.它是在实验数据的基础上建立的经验或半经验关联模型假设细胞生长过程，各子成份均以相同的比例生长把细胞和培养液视为一相（液相）,不考虑培养液和

5、细胞之间的物质传递作用,即均一化模型对细胞群体的描述模型 （3）反应速率的定义 绝对速率dtdcrXXdtdcrdtdcr22OOSS dtdHrdtdcrdtdcrVHCOCOPPV22 相对速率细胞生长比速率细胞生长比速率底物消耗比速率底物消耗比速率氧消耗比速率氧消耗比速率产物生成比速率产物生成比速率反应热生成比速率反应热生成比速率 hJ/kg q h h h h -1-1-1-1dtdHc1dtdcc1qdtdcc1qdtdcc1qdtdcc1VxHPXPOxOSxSxxV22比速率与催化活性物质的量有关。因此比速率的大小反映了细胞活力的大小。比速率与催化活性物质的量有关。因此比速率的大

6、小反映了细胞活力的大小。4.2.2 无抑制细胞生长动力学式中式中:cS限制性底物质量浓度，限制性底物质量浓度，g/L；Ks饱和常数，其值等于生长比速率恰为最大生长比速率的浓度一半时饱和常数，其值等于生长比速率恰为最大生长比速率的浓度一半时的限制性底物浓度。的限制性底物浓度。SSSmaxcKc 当限制性底物浓度很低时，当限制性底物浓度很低时，csKs时，若继续提高底物浓度，细胞生长速率基本不变。时，若继续提高底物浓度，细胞生长速率基本不变。此时细胞生长比速率与底物浓度无关，为零级动力学特点。此时细胞生长比速率与底物浓度无关，为零级动力学特点。SSmaxcKXmaxxcrSSSmaxcKcXSSS

7、maxXxxccKccdtdcr18)-(4 St0S0XXtS/XccccY48)-(4 )cc (Y1cc0XXS/X0SS50)-(4 XXS/X0SSXS/X0SmaxxccY1cKcY1cr49)-(4 X0XXS/X0SS0XXS/X0Smaxxc)cc (Y1cK)cc (Y1crLttSSSecKc/max102 . 4 . 2 . 4Xdxxckdtdcr稳定期动力学Xdxdckdtdcr细胞死亡动力学3 . 4 . 2 . 44.2.4 细胞生长延迟期、稳定期、死亡起和细胞维持动力学细胞生长延迟期、稳定期、死亡起和细胞维持动力学4.2.4.1 延迟期动力学延迟期动力学Xxd

8、cdtdcrm4 . 4 . 2 . 4细胞维持期动力学4.2.5 温度对细胞生长速率的影响温度对细胞生长速率的影响RTEdRTEXdxxdaeAkAeckdtdcr/0/4.3 底物消耗与产物生成动力学4.3.1 底物消耗动力学碳源碳源简单的碳化合物简单的碳化合物能量以能量以ATP形式储存形式储存分解分解氧氧从细胞排出从细胞排出COCO2 2和水和水新细胞物质新细胞物质以复杂的生以复杂的生化物质排除化物质排除维持能量供给维持能量供给图图4-10 细胞中碳的利用及能置的来源与消耗途径细胞中碳的利用及能置的来源与消耗途径(1) 底物消耗速率与消耗比速率底物消耗速率与消耗比速率16)-(4 /Sx

9、SxSxSXrrdtdmdtdmdmdmY72)-(4 XsssmaxS/XXS/XXS/XSccKcY1cY1rY1r73)-(4 sssmaxS/XSXScKcY1rc1qmaxS/Xmax, SY1：q令74)-(4 sssmax,SScKcqq底物最大消耗比速率底物最大消耗比速率底物底物消耗消耗比速率比速率 单位体积培养液中的细胞在单位时间内摄取单位体积培养液中的细胞在单位时间内摄取(消耗消耗)氧的氧的量称为摄氧率量称为摄氧率(OUR)或氧的消耗速率，可表示为：或氧的消耗速率，可表示为：75)-(4 XO/XOrY1r276)-(4 O/XOY1q2与细胞浓度之比，为耗氧比速率，或称为

10、呼吸强度。与细胞浓度之比，为耗氧比速率，或称为呼吸强度。2Or77)-(4 XOOcqr22 当底物既是能源又是碳源时、就应考虑维持能所消耗的当底物既是能源又是碳源时、就应考虑维持能所消耗的底物。维持能用于维持其渗透压，修复底物。维持能用于维持其渗透压，修复DNA、RNA和其他大和其他大分子。维持细胞的结构和生命活性。因此，对底物消耗动力分子。维持细胞的结构和生命活性。因此，对底物消耗动力学方程中必须考虑维持能这一项。学方程中必须考虑维持能这一项。 底物消耗速率可表示为底物消耗速率可表示为(2) 包括维持能的底物消耗动力学包括维持能的底物消耗动力学78)-(4 XXS/X*SmcrY1rSGx

11、*S/XmmY72)-(4 XsssmaxS/XXS/XXS/XSccKcY1cY1rY1rXSXSrYr/14.3.2 代谢产物生成动力学一相关模型： 是指产物的生成与细胞的生长过程相关，即产物通常是基质的分解代谢产物(如乙醇发酵)或代谢过程的中间产物(如氨基酸发酵),代谢产物的生成与细胞的生长是同步的。 产物的生成速率为： XX/PXX/PPPcYrYdtdcrX/PPYq等式两边除以X，则有：Pq说明：第一项与细胞生长有关，第二项无关 ；、由细胞生理特性与生长条件而定，只有通过对不同的细胞代谢过程进行研究，才能找出其与细胞生长条件、环境因素的关系。 二部分相关模型： 产物的生成与细胞生长

12、部分相关。动力学方程为：XXPcrr三非相关模型： 产物的生成与细胞的生长无直接关系，特点是当细胞处于生长阶段时，并无产物积累，而当细胞生长停止后，产物却大量生成 。4.4 微生物受热死亡动力学生物体种类相对耐热性营养细胞及酵母噬菌体和病毒霉菌孢子细菌芽孢各种不同微生物在含湿加热时所呈现的相对耐热性各种不同微生物在含湿加热时所呈现的相对耐热性设计灭菌操作，必须以细菌芽孢作为杀灭对象，因为要杀灭了芽孢，其他杂菌一定也杀灭。这一点，既是食品灭菌的依据，同时也是发酵培养基灭菌操作的基础。n微生物受热死亡的原因主要是因高温使微生物体内的一些重要蛋白质，如酶等发生变性，从而导致微生物无法生存而死亡。n微

13、生物受热死亡的规律有很多类型，但常见的是对数死亡律，也称对数残存律。-dN/dt=kN其中：N是活菌体浓度，以活菌体个数/mlK是比死亡速率常数，min-1t是时间对数死亡律-dN/dt=kNln(N/N0)=-ktN=N0exp(-kt)t=2.303log(N/N0)/kk值反应了微生物耐热性的强弱，越小表明微生物越不易热死；反之越易热死。生物体种类k值营养细胞及酵母细菌芽孢各种不同微生物各种不同微生物k值值dNR/dt=-kRNRdNS/dt=-krNR-kSNSkr耐热芽孢的比失活速率常数，kS耐敏感中间芽孢的比失活速率常数，联立求解微分方程组的：N/N0=kRexp(kSt)-kS/

14、krexp(-krt)/(kR-kS)死亡速率常数k与温度的关系，可用阿累尼乌斯公式来表示： K=Aexp(-E/RT)或 lnK=lnA- E/RTA:A:频率常数，频率常数，min-1min-1EE：死亡活化能，：死亡活化能，J/molJ/molT T：绝对温度：绝对温度R R：气体常数：气体常数E/RE/R：微生物受热死亡时对温度敏感性的度量，越大，随温度的变化越敏感。：微生物受热死亡时对温度敏感性的度量，越大，随温度的变化越敏感。绝对温度的倒数，1/T对数比死亡速率常数，lnk斜率， -E/Rn当培养基加热灭菌时，常会出现杂菌被杀灭的同时，营养物质也被破坏，如何解决这一矛盾？n对表达式

15、lnK=lnA- E/(RT)取微分：dlnK=- E/Rd(1/T)方程中，E越大，对于同样的d(1/T)， dlnK变化越大。n微生物受热死亡的活化能一般要比营养成分热分解的活化能大的多，这就意味着当温度升高时，微生物的死亡速率要比营养成分的破坏速率增加的多，这就是为什么采用高温、瞬时灭菌-HTST (High Temperature Short Time)。n一般芽孢的E约为293100J/mol，营养成分的E约为83740J/mol。n嗜热脂肪芽孢杆菌的死亡和维生素B1的热分解距离：温度从105 升高到130 ，芽孢的K值将从0.1min-1增加至26.82min-1，增大268268

16、倍；但同样的温度变化， B1的K值从0.019min-1增加至0.117min-1，增大6.166.16倍。灭菌温度， 需要的灭菌时间，min维生素B1的损失，%1001001101101201201301301401401501501232123211411411.811.81.371.370.1770.1770.02520.025299.9999.9995.795.749.649.614.814.83.953.951.01.0不同灭菌温度和不同灭菌时间下，维生素不同灭菌温度和不同灭菌时间下，维生素B1B1的破坏对照的破坏对照灭菌度灭菌度N/NN/N0 0=10=10-16-164.5 培养

17、基灭菌的工程设计整个灭菌过程由加热、保温和冷却三个阶段组成，每一阶段均有菌体的死亡，整个间歇过程的灭菌作用是这三个阶段的总和。ttdtRTEAkdtNN000)/exp(ln总ttdtRTEAkdtNN000)/exp(ln总在保温阶段，K为常数，可以直接积分，在升温和冷却阶段K是变化的，即温度T是时间的函数，而且这些经验函数关系非常复杂（一般不推介使用这些公式），积分过程很复杂，往往使用数值法求解；加热和冷却可以从一些手册中查得。TTNVVNNN00lnln总VT培养基的总体积；N0VT每批培养基开始的杂菌总数； NVT培养基灭菌后的杂菌数。如果残留一个杂菌，如果营养物充足，经过24小时，倍

18、增时间20分钟计算，这个杂菌将繁殖成 (2)72;如果一个杂菌不留，则NVT=0，这也办不到，如果达到此灭菌度，灭菌时间需无穷大；实际计算中常常取NVT=10-3，表示1000次发酵中，将可能由于灭菌不当而残留一个杂菌。NVT通常根据操作难易、灭菌费用、产品和培养基的代价等多方面因素决定。加热阶段保温阶段冷却阶段一般来讲，完成整个灭菌周期约3-5小时，各阶段对灭菌的贡献大致如下：加热/ 总=0.20;保温/ 总=0.75；保温/ 总=0.05尽量缩短加热时间，可减少营养物的减少。n与间歇灭菌相同，连续灭菌也需要加热、保温和冷却三个阶段；n间歇灭菌这三个阶段在空间上相同，在时间上不同；n连续灭菌

19、这三个过程同时发生，但在空间上不同，因此需要有加热设备、保温设别和冷却设备。4.5 细胞反应动力学参数的估计动力学实验的目的动力学实验的目的1.确定反应速率与反应物浓度之间的函数关系，这实际上是确立速率方确定反应速率与反应物浓度之间的函数关系，这实际上是确立速率方程的基本形式；程的基本形式；2.确定动力学参数，例如细胞反应器中的确定动力学参数，例如细胞反应器中的Ks和和max的值；的值；3.确定动力学参数与反应条件，例如温度、确定动力学参数与反应条件，例如温度、pH等因素的关系。等因素的关系。动力学方程是否合适，动力学参数的值是否正确，取决于实验设备和实验方法动力学方程是否合适，动力学参数的值是否正确，取