乙型、丙型、庚型肝炎病毒多重感染研究

1、    乙型、丙型、庚型肝炎病毒多重感染研究杜绍财 陶其敏 常锦红 朱凌 【摘要】 目的 探讨庚型肝炎感染患者是否存在双重感染和多重感染。方 法 应用庚型肝炎病毒(HGV)NS3区逆转录聚合酶链反应技术检测了HGV系列稀释的 质控血清及Abbott GBV-C参比样品中HGV RNA，并对90例丙型肝炎病毒(HCV)RNA 阳性和12例乙型肝炎、丙型肝炎双重感染献血员进行了HGV RNA的检测。结果HGV系 列稀释质控血清10-110-5均为阳性；10-6为阴性。2份Abbott GBV-C样品均为 HGV RNA阳性。90例HCV RNA阳性样品中，8

2、例HGV RNA阳性(17.8%)；12例乙、丙 双重感染者中4例(4/12)HGV RNA阳性。结论 不仅存在HCV及HGV双重感染，也存在 多重感染。 【关键词】 肝炎病毒，庚型 肝炎病毒，丙型 逆转录聚合酶链反应 Studies on Multiple Infection with Hepatitis B, C and G Viruses Du Shaocai, Tao Qimin, Chang Jinghong, et al. Institute of Hepatology, People"s Hospital, Beijing Medical University, Bei

3、jing 100044 【Abstract】 Objective To study if there exists superinfection and multiple infection in the patients with hepatitis G virus (HCV) infection. Methods Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) technique in non-structural gene 3 (NS3) region of HGV was used to detect HGV RNA i

4、n serially diluted quality control sera and HGV-C reference panel of samples provided by Abbott Co. Ltd, in 90 cases with positive hepatitis C virus (HCV) RNA, and 12 blood donors with super-infection of hepatitis B virus (HBV) and hepatitis C virus (HCV). Results Serially diluted quality control se

5、ra showed positive for HGV RNA at dilutions of 10-1to 10-5, but negative at dilutions of 10-6 to 10-8. HGV RNA was positive in two samples of HGV-C serum provided by Abbott Co. HGV RNA was positive in eight of the 90 cases with positive HCV RNA and in four of the 12 cases with super-infection with H

6、CV and HBV. Conclusion There are not only super-infection of HBV and HCV, but also multiple infection. 【Key words】 Hepatitis G virus Hepatitis C virus Reverse transcription polymerase chain reaction 自从1995年美国Simons等及Linnen等证实存在庚型肝炎病毒GBV- C和HGV以来，引起了广大研究人员的极大重视。日本、西欧、澳大利亚、中国 等均有庚型肝炎病毒的存在。通过基因序列分析研究证实

7、，GBV-C和HGV两者具有 高度的同源性，为庚型肝炎病毒的不同株，一些流行病研究资料也证实，庚型肝 炎病毒与丙型肝炎病毒具有相同的传播方式。本文对90例HCV RNA阳性的患者血 清及10例抗-HCV阳性的献血员进行了双重感染研究，结果如下： 材料与方法 一、材料 1.血清样品：90例HCV RNA阳性样品来自本院的门诊病人。 2.HGV RNA质控血清来自我国河北地区HBsAg阳性献血员，并经日本自治医 科大学证实HGV RNA阳性。 3.GBV-C参照血清：07648F9及52953：236血清均由Abbott赠送。 4.HGV NS5区PCR试剂盒来自本研究所。 5.HGV NS3区P

8、CR试剂盒由本研究所生产，HGV NS3区外引物序列按文献报道合 成，内引物正链5"-CATTCVAAGGCGGAGTGYGC-3"，负链5"-TCYT TACCCCTRTAATAGGC-3"。 6.HCV RNA PCR试剂盒由本研究所提供，按文献方法进行。 7.HBV免疫PCR试剂盒由本研究所提供，按文献报道方法进行。 8.HBsAg EIA试剂盒上海科华生物公司产品。 9.HBeAg、抗-HBe EIA试剂盒为本研究所产品。 二、方法 1.HGV NS3区PCR：采用异硫氢酸胍裂解法，HGV RNA提取方法及PCR程序如 下： (1)提取RNA：取

9、血清20 l加裂解液(含异硫氢酸胍)80 l，混匀后置室温 5分钟，加入氯仿：异戊醇(491)40 l，稀释液(含RNasin)80 l，10 000 r/min 离心10分钟，吸取上清液100 l，加入等体积异丙醇(或-20保存)，12 000 r/min离心15分钟，吸去上清，沉淀物含HGV RNA。 (2)逆转录：在上述含HGV RNA原管内加入逆转录反应混合液(含AMV Buffer dNTP及HGV引物)10 l，70 12分钟后，加入AMV反转录酶34个单位，42 40分钟后即可进行PCR扩增。 (3)第一次PCR：在逆转录原管内加入第一次PCR反应混合液(含缓冲液、引物 及1单位

10、Taq酶)20 l，石蜡油封顶，超薄管扩增程序94 30秒，55 30秒， 72 45秒35个循环。 (4)第二次PCR：取第一次PCR产物3 l，加第二次PCR反应液(含缓冲液引物 dNTP及1单位Taq酶)30 ml，在同一条件下扩增35个循环。 2.HGV NS5区PCR：引物设计与操作方法按文献方法进行。 3.PCR产物的检测：采用聚丙烯酰胺(PAGE)电泳技术检测PCR产物，NS5区第 一次PCR产物380 bp，第二次PCR产物为210 bp；NS3区第一次PCR产物158 bp处有 cDNA带，及第二次PCR产物83 bp处有cDNA带为HGV RNA阳性。 结果 1.90例HC

11、V RNA阳性患者中HGV RNA检测结果：90例HCV RNA阳性患者中8例 HGV RNA阳性，阳性率为17.8%。 2.HGV RNA质控血清灵敏度检测结果：取参照血清100 l加入无菌小牛血 清900 l定为10-1，依次稀释至10-6。结果表明，原血清10-110-4为强阳性， 10-5为阳性，10-6为HGV RNA阴性(附图)。 3.GBV-C参照血清HGV RNA检测结果：应用HGV NS3区套式PCR技术检测， Abbott的两份样品52953236及07648F9均为阳性。 M分子量标志物：Hae PGEM3DNA17分别为原血清、10-1、10-2、10-3、 10-4、

12、10-5、10-6811为HGV RNA阳性患者血清样品电泳条件为6%聚丙烯 酰胺凝胶、电极液TAE 附图 HGV RNA质控血清灵敏度检测结果 4.12例HBsAg阳性的携带者中HGV RNA及HCV RNA检测结果：2、3、4、5、 7、10、11、12均为HBV DNA第一次PCR阳性，其中1、9为第二次PCR阳性， 6、8为二次PCR均为阴性。HCV RNA为5端非编码区检测结果，HGV RNA以HG V NS3区及NS5区两者同时阳性为判断标准(附表)。 附表 12例HBsAg阳性携带者HGV、HCV RNA检测结果 样品号 HBsAg HBeAg 抗- HBe HBV DNA 抗-

13、 HCV HCV RNA HGV RNA 1 + - + + + + - 2 + + - + + + - 3 + + - + + + - 4 + + - + + - - 5 + + - + + + - 6 + - + - + + - 7 + + - + + + + 8 + - + - + + - 9 + + - + + + + 10 + + - + + + + 11 + + - + + + + 12 + - 未测 + + + - 讨论 本文应用HGV NS3区套式PCR技术检测了美国Abbott赠送的两株GBV-C样品， 并检测经日本证实为HGV RNA阳性样品(为本研究所的质控血清)，结果表

14、明在 83bp处均有较强的cDNA带，表明本试剂盒采用的NS3区套式PCR具有一定优势， 不仅能检出美国的GBV-C株，同时也能检出经日本检出的中国珠。 90例HCV感染患者的HGV RNA检测结果表明，有HCV HGV双重感染的存在。 结果表明，在12例HBV、HCV双重感染的献血员样品中检出HGV RNA阳性4例， 均未检测到HDV、EBV、HAV、HEV及CMV，提示至少存在HBV、HCV双重感染，这 种感染和多重感染是否对肝病的慢性化、肝硬化及肝癌有促进作用，有待进一 步研究证实。 作者单位：北京医科大学人民医院肝病研究所 100044 参考文献 1Simons JN, Leary T

15、P, Dawson GJ, et al. Isolation of novel virus-like sequences associated with human hepatitis. Nat Med, 1995, 1:564-569. 2Linnen J, Wages J, Zhang-keck ZY, et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: a transfusion-transmissible agent. Science, 1996, 271:505-508. 3陈红松，王宇，魏来，等.中国人庚型肝炎病毒部分基因的克隆及序列分析