紫杉醇对骨髓细胞体外诱导分化的巨噬细胞影响

1、紫杉醇对骨髓细胞体外诱导分化的巨噬细胞影响         11-01-30 10:47:00     编辑：studa20                   作者：李龙, 沈红, 陈静, 赵勇 【摘要】  目的: 研究紫杉醇对小鼠骨髓分化巨噬细胞的直接影响。方法: 常规方法无菌制备BA

2、LB/c小鼠骨髓细胞, 用含MCSF的RPMI1640培养液培养7 d, 同时加入不同浓度紫杉醇, 通过流式细胞术对骨髓单核细胞分化的巨噬细胞的表型分子、 吞噬功能进行测定, 采用迟发型过敏反应（DTH）方法检测巨噬细胞免疫原性。结果: 紫杉醇明显降低骨髓单核细胞分化成巨噬细胞的数量; F4/80+巨噬细胞表面分子CD80、 CD14表达升高, 而IAd表达降低; 紫杉醇提高分化的巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力; 但使其免疫原性降低。结论: 紫杉醇能使骨髓单核细胞分化的巨噬细胞细胞吞噬能力提高, 但其免疫原性下降, 提示紫杉醇可能具有调节巨噬细胞免疫功能的作用。 【关键词】  紫杉醇;

3、巨噬细胞; 吞噬紫杉醇最早是从北美短叶红豆杉树皮中分离得到的双萜酰胺类化合物, 由于其具有独特的抗癌活性而成为当今抗癌药物研究的热点。紫杉醇抗癌作用一是诱导和促进肿瘤细胞微管蛋白聚合而不发生解聚, 使微管过于稳定从而抑制纺锤体的形成, 致使染色体不能向两极移动最终阻止有丝分裂的完成, 从而抑制肿瘤细胞生长; 二是紫杉醇调节多种凋亡相关的基因或蛋白, 诱导细胞凋亡1, 2; 三是紫杉醇激活巨噬细胞产生NO、 IL、 TNF等杀灭肿瘤细胞3。其他研究还表明, 紫杉醇具有LPS样作用, 即紫杉醇能够作用免疫细胞, 尤其是巨噬细胞, 下调巨噬细胞表面TNF受体的表达, 诱导TNF的释放, 也能促进IL

4、1、 IFN和IFN的释放。还有研究表明, 在大鼠的器官移植模型中, 紫杉醇能够降低受者产生抗供者的细胞毒性抗体, 而且能降低细胞毒性T细胞的活性和IL2的产生, 结果提示在器官移植中紫杉醇可能有潜在的免疫抑制作用4。巨噬细胞是紫杉醇作用的主要效应细胞, 研究紫杉醇对巨噬细胞分化能力的直接影响, 为紫杉醇作为免疫调节剂应用提供实验依据。1  材料和方法11  材料  CO2培养箱为日本SANYO产品,  FASCalibur型流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司, 千分尺购自Brown & Sharpe公司, RPMI1640培

5、养基、  胎牛血清购自美国HyClone公司, MCSF、 紫杉醇抗FcR mAb（2.4G2, 移植生物学实验室制备）和8.3 g/L红细胞裂解液（TrisNH4Cl）购自Sigma公司, DMSO（Amresco,  ACS,  Grade）, 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE;  Molecular Probes,  Inc. Eugene,  OR)。 PE标记的抗小鼠F4/80 单克隆抗体（mAb）（BM8）, PE标记的大鼠抗小鼠的IAd mAb (39108), FITC标记的仓鼠抗小鼠的CD80 (B71) m

6、Ab (1610A1;  IgG2b), FITC标记的大鼠抗小鼠的CD14 mAb (MP9;  IgG2b), FITC标记的大鼠抗小鼠的CD11b mAb (M1/70;  IgG2b), 以上抗体均购自于BD Biosciences Pharmingen (San Diego,  CA)。SPF级68周龄雌性BALB/c小鼠和SPF级68周龄雌性C57BL/6小鼠均购于军事医学科学院实验动物中心。12  方法121  小鼠骨髓单核细胞的制备  取BALB/c小鼠颈椎脱臼致死。无菌剥取胫骨、 股骨和髂骨, 剪去骨两端,

7、 用RPMI1640冲洗骨髓腔得到骨髓细胞, 1 600 r/min, 离心6 min, 弃上清, 加入红细胞裂解液消化红细胞, 然后用RPMI1640培养液洗3次, 将分离得到的骨髓细胞加入培养皿中, 37、 50 mL/L CO2培养箱中培养2 h。吸取未贴壁细胞, 1 600 r/min, 离心6 min, 细胞计数, 调整细胞密度为1×109/L, 加入6孔细胞培养板, 然后向其加入含100 g/L MCSF的RPMI1640完全培养液, 37、  50 mL/L CO2培养箱内培养7 d5。122  实验分组  分3组: MCSF组（100 g

8、/L）、 MCSF+紫杉醇（20 g/L）组和MCSF+DMSO（1  g/L）组, 每组设4个重复孔, 所有实验重复3次。123  流式细胞术检测  收集诱导分化培养7 d的各组细胞于离心管内, 分别加入FACS缓冲液, 将细胞稀释成调成4×109/L, 取100 L悬浮的细胞, 加2.4G2  10 L, 封闭细胞表面Fc受体。同时加入不同荧光标记的抗体各10 L, 混匀, 4孵育30 min。加入FACS缓冲液, 1 600 r/min, 离心5 min, 洗去游离的荧光抗体, 重复2次。轻轻混匀悬浮细胞, 上流式细胞仪测定6。124&#

9、160; 巨噬细胞吞噬鸡红细胞的测定  巨噬细胞的收集: 收集诱导分化培养7 d的各组细胞, 用RPMI1640调细胞密度为2×108/L, 加入24孔细胞培养板, 培养2 h。CFSE标记鸡红细胞: 鸡翅采血, 制备新鲜鸡红细胞, PBS洗2次, 调整细胞密度为4×1010/L, 加入CFSE 5.0  mol/L,  37、 15 min, PBS洗2次, 调整CFSE标记的细胞密度约为2×109/L, 然后将其加入到含有巨噬细胞的24孔培养板中, 37、  50 mL/L CO2培养箱共孵育2.5 h, 收集细胞, 上

10、流式细胞仪检测。125  迟发型过敏反应（DTH）  制备BALB/c小鼠脾细胞, 免疫C57BL/6小鼠, 10 d后取C57BL/6脾细胞, 调整细胞密度4×108/L, 作为刺激细胞。收集诱导分化7 d的巨噬细胞, 调整细胞密度为4×108/L, 作为反应细胞。反应细胞和刺激细胞11混合, 给正常C57BL/6小鼠耳朵皮层内注射。用千分尺分别测量注射前和注射后24 h和48 h小鼠耳朵厚度7。126  统计学分析  实验数据都以x±s表示, 平均数间比较用t检验, 方差不齐时用t检验,  P<0.05差

11、异具有统计学意义。2  结果21  紫杉醇对诱导分化的巨噬细胞形态和分化的影响  用MCSF和加入不同浓度紫杉醇（5、 10、 15、 20g/L）的RPMI1640培养液培养骨髓细胞7 d, 收集诱导分化的巨噬细胞, 对不同处理组的细胞形态和数量进行分析, 结果显示, MCSF和DMSO组细胞形态没有变化（图1A）。不同浓度紫杉醇都能抑制骨髓细胞分化成巨噬细胞（图1B）, 1020 g/L紫杉醇使骨髓细胞分化成巨噬细胞数量明显降低（P<0.05）。与对照组比较, 20 g/L紫杉醇处理骨髓细胞对诱导分化成的巨噬细胞表面的特异标志物F4/80表达没有影响,

12、各组巨噬细胞表面分子F4/80表达的阳性率接近100%（图1C）。图1  紫杉醇诱导分化的巨噬细胞形态和数量的变化（略）Fig 1  The cell count and morphology of macrophages induced by paclitaxelA:  The morphology of macrophages in different treated groups; B:  The cell count of macrophages treated with paclitaxel;  C:  The identification of m