桂利嗪对兴奋毒致痴呆大鼠模型海马单胺类神经递质的影响

1、桂利嗪对兴奋毒致痴呆大鼠模型海马单胺类神经递质的影响         11-01-11 11:41:00     作者：苏湲淇 董志    编辑：studa20【摘要】  目的研究桂利嗪(Cin)对兴奋毒诱导的阿尔茨海默病(AD)模型学习记忆能力的改善及其对海马单胺类神经递质的影响。方法应用微量注射方法，将喹啉酸(QA)注入大鼠双侧海马CA1区，建立大鼠AD学习记忆障碍模型，观察Cin对实验大鼠行为学、病理组织形态学和神经生化

2、学相关指标的影响。结果Cin可降低模型大鼠Morris水迷宫实验中其寻找平台平均潜伏期及穿梭箱实验中回避潜伏期，并明显减轻其脑组织病理损伤;可剂量依赖性地增加模型大鼠海马中酪氨酸羟化酶(TH)、色氨酸羟化酶(TPH)的阳性细胞的数量，而去甲肾上腺素(NA)、多巴胺(DA)和5-羟色胺(5-HT)含量也有明显的增加。结论Cin能通过增加单胺类神经递质的含量来改善AD大鼠学习记忆能力。 【关键词】  桂利嗪;兴奋毒;单胺类递质兴奋性毒性损伤是中枢神经系统疾病和损伤时神经元变性坏死的重要机制之一1。喹啉酸(QA)是一种潜在的内源性毒物，有研究在海马CA1区注入QA，利用其选择性破坏谷氨酸(

3、Glu)能神经元的特性，制备成Glu能毁损的学习记忆障碍模型2。桂利嗪(Cin)为钙离子阻断剂，对脑缺血损伤具有良好的疗效3，4，但Cin对QA所致海马神经元损伤是否有保护作用尚未见报道。本实验利用兴奋毒损伤方法建立大鼠阿尔茨海默病(AD)模型，研究Cin对AD动物模型学习记忆能力的影响及其对单胺类神经递质的保护作用，为其防治提供理论依据。1材料与方法1.1动物与仪器雄性4月龄健康Wistar大鼠60只，清洁级，体质量(220±23)g，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，实验动物合格证号SCXK (军)2002008。脑立体定位仪(西北光学仪器厂)，Morris 水迷宫和大鼠穿

4、梭箱(中国医学科学院药研所)，3k30型低温超速离心机(美国Sigma公司)，BH-2型光学显微镜(Olympus，日本)。1.2药品与试剂Cin(美国Sigma公司，批号20021206，含量>99.4%)，QA(Aldrich 化学公司，批号20010701，含量>99.6%)，酪氨酸羟化酶(TH)测定试剂盒、色氨酸羟化酶(TPH)检测试剂盒均由武汉博士德公司提供。免疫组化试剂盒由北京中杉公司提供。1.3动物分组动物经行为学筛选后，按随机数字表法分为5个组，假手术组、模型组及3个Cin治疗组(n=8)。3个Cin治疗组为动物手术后立即分别灌胃Cin 7、20、60 mg/kg;

5、假手术组及模型组分别给予等量灭菌生理盐水灌胃。1.4模型的制作5实验动物用水合氯醛以350 mg/kg经腹腔注射麻醉后，剪去颅顶切口区毛，固定在大鼠脑立体定位仪上。酒精消毒后，取颅顶正中切口，参照大鼠脑立体定位图谱6(AP：3.5 mm， ML:2.0 mm，H:2.7 mm)，对双侧海马CA1区立体定位后，钻开颅骨，用微量注射器垂直进针，将溶解的QA 2 l(含150 nmol)缓慢注入海马CA1区，假手术组注入等量的PBS缓冲液。每侧注入时间为5 min，留针5 min，局部消毒后缝合皮肤。1.5行为学检测模型制备后1 w，采用Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆能力7，8。前4 d进行

6、定位航行实验，记录大鼠寻找平台潜伏期，用于测量大鼠对水迷宫学习和记忆的获取能力。第5天进行空间搜索实验，记录大鼠在120 s内跨过平台相应位置的次数。以穿梭箱实验检测大鼠条件性学习记忆能力9，设定好实验参数后，打开电源，观察大鼠躲避电击情况，同时计算机自动记录大鼠主动回避次数(AART)、被动回避潜伏期(ERL)和主动回避潜伏期(AARL)。1.6病理组织形态学观察HE染色行为学实验结束后，每组取1或2只大鼠实施内固定脑组织。将大鼠断头，快速取出脑组织，放入4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察大鼠双侧海马神经元改变。尼氏体染色每组随机取1或2只大鼠实施内固定脑组织。然后将大鼠

7、断头，快速取出脑组织，放入4%多聚甲醛中固定，做石蜡切片。然后在0.3%甲苯胺蓝中浸染20 min，再经二甲苯和梯度乙醇脱蜡处理，在400倍光镜下观察各组标本海马CA1区的尼氏体形态改变。TH和TPH免疫组化法染色将组织切片粘贴于经多聚赖氨酸处理过的载玻片上，石蜡切片经二甲苯和梯度乙醇脱蜡处理后，作SABC免疫组化染色，参照北京中山公司的试剂盒说明进行，每张切片滴加50 l一抗(稀释度为1200，Sigma公司)，4 孵育过夜，滴加生物素化山羊抗兔IgG(稀释度为1150，博士德生物制剂公司)，37 孵育，PBS漂洗， 滴加SABC， 37 孵育，PBS 漂洗，DAB显色，常规复染，二甲苯透明

8、，中性树胶封片。阳性细胞为细胞质或细胞核呈棕黄色。1.7神经生化学观察假手术组和模型组各取6只大鼠，快速断头，迅速取出大脑，在冰台上分离出海马，用4 生理盐水冲洗除去血液，在干冰上用滤纸拭干，称重后立即置于冰浴的玻璃匀浆器中，以每mg组织加入0.01 mol/L的高氯酸，于冰浴里匀浆，匀浆速度尽可能保持一致，然后转入有塞的离心管中，在低温离心机内以18 000 r/min的速度离心20 min。然后参照刘德敏及张林魁之高效液相色谱电化学检测法测量样品中去甲肾上腺素(NA)、多巴胺(DA)和5-羟色胺(5-HT)的含量10。1.8统计学方法采用EXCEL录入，采用SPSS11.5统计软件进行方差

9、分析，计量资料均用x±s描述，多组间比较采用单因素方差分析，重复检测的数据采用重复测定的方差分析。2结果2.1Cin对QA损伤大鼠空间学习记忆能力的影响(Morris水迷宫实验) 训练4 d各组共8次的平均潜伏期， Cin(20、60 mg/kg)使损伤大鼠寻找平台平均潜伏期减少，见图1，并使其末次跨平台次数明显增加，假手术组、模型组、Cin(7 mg/kg)、Cin(20 mg/kg)和Cin(60mg/kg)的末次跨平台次数分别为：11.25、5.26、6、7.63和10.25，其中Cin(20、60mg/kg)与模型组相比有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。

10、2.2Cin对QA损伤大鼠条件性学习记忆能力的影响训练图1大鼠水迷宫寻找平台平均潜伏期4 d后， Cin(20、60 mg/kg组)可剂量依赖性地增加QA损伤大鼠的主动回避次数，降低主动回避潜伏期及被动回避潜伏期，与模型组相比有显著差异(P<0.05，P<0.01)，见表1。2.3HE染色HE染色后光镜下观察，可见正常大鼠海马CA1区神经元数目多，呈多层，排列整齐紧密，核呈圆形，大而清晰，核仁明显，神经纤维密集，排列整齐。QA损伤组海马神经元数目明显减少，脱失现象明显，层次少而不清，排列紊乱，核固缩为三角形或多角形，浓染，神经纤维稀疏，排列紊乱，间隙扩大。Cin(20、60 mg/kg)能明显改善QA损伤大鼠海马神经元的损伤，使海马神经细胞数目明显增加，排列较整齐，核固缩现象明显改善，核仁较清晰，神经纤维也明显增加，7 mg/kg剂量组的Cin改变不明显，见图2。QA急性损伤后，模型组尼氏体数量为130.69个，较假手术组(217.53)明显减少(P<0.01)。Cin(20、60 mg/