双波长法快速测定蛋白质含量

1、苏州医学院学报 2000 ;20 (1)39朱华亭刘继明殷昌硕张学光(苏州医学院免疫学研究室 ,苏州 ,215007)摘要目的为了建立一种快速而灵敏的蛋白质检测方法。方法在考马斯亮兰法测定蛋白质含量时 ,通过采用 590nm和 450nm双波长代替单波长检测 ,并以酶标检测仪取代紫外 -可见分光光度计作为检测仪。结果此种改进不但提高了考马斯亮兰法检测蛋白质的灵敏度 ( 0. 127g/ ml)和检测范围 ( 0. 12731. 25g/ ml) ,而且使大量标本的检测可在一次检测过程中完成。标准直线相关系数 r = 0. 9965 ,表明在检测限内 A / A和蛋白质浓度 C呈良好线形关系。结

2、论双波长法可作为一种快速、敏的蛋白质检测方法。关键词蛋白质 ;定量 ;双波长 ;考马斯亮兰中图法分类R392 - 33Rapid Two - colorimetric Assay for Protein QuantitiesZhu Huating , L iu Ji ming , Yin Changshuo , et al(Depart ment of Immunology Suzhou Medical College ,Suzhou ,215007)AbstractObjectiveTo improve t he sensitivit y of t he Coomassie brillian

3、t blue protein assay.MethodsThe Coomassie brilliant blue assay is accomplished by measurement of absorbance at 590and 450nm. To linear wit h protein concent ration by t he ratio of t he absorbance ,590 nm over 450 nm ,toreader as t he detecting equipment . ResultsThis simple process increases t he a

4、ccuracy and improvessionsThis assay can be as sensitive and rapid a met hod for protein quantities.Key wordsProtein quantit y ; two - colorimet ric ; Coomassie brilliant blue考马斯亮兰蛋白质定量法 ,也被称为 Bradford本 ,能减少系统误差。本实验拟用双波长代替单波测定法 1 。该方法具有易开展 ,快速和对蛋白质特长 ,并用酶标仪代替紫外 -可见分光光度计提高检异性好 ,所以被广泛用于蛋白质的测定 2 。但该方测灵敏

5、度。法也有其局限性 ,首先其检测灵敏度较低 ,只能检测mg级水平的蛋白质 ;其次 ,考马斯亮兰检测的线性 1材料和方法范围窄 ,在 2 10g/ ml之间 3 。鉴于其有上述缺 1. 1试剂 :考马斯亮兰 G - 250和结晶牛血清白蛋点 ,是否能通过方法上的改进 ,拓展考马斯亮兰法的白 (购自 Sigma)。其它所用试剂为分析纯 ,去离子应用范围。在酸性条件下 ,考马斯亮兰染料呈红色 ,双蒸水作为溶剂。2 亮兰染料和考马斯亮兰 -蛋白质结合物有不同的吸 50ml 95 %乙醇中 ,再加入 100ml的浓磷酸 ( 85 %光系数。传统考马斯亮兰法利用考马斯亮兰 -蛋白 W/ V) ,最后加蒸馏

6、水至 200ml ,此染料于 4避光结合物最大吸收波长 595nm时的吸收度 A来反映可存放 6个月。临用前 1稀释。蛋白质的浓度 ,而忽略了游离考马斯亮兰染料在此 1. 3吸收光谱测定 :将染料 1稀释并过滤 ,在干波长下也有一定的吸收度。在 EL ISA检测和 M T T净试管内加入 0. 8ml稀释好的染料 ,再加入 0. 2ml测定中 ,常利用双波长法来消除杂吸收的影响从而的待测样本 ,对照品为蒸馏水 ,反应时间至少 5min ,提高检测的灵敏度 4 。酶标仪可一次检测大量标但不超过 30min。用紫外 -可见分光光度计 (上海3国防科技预研项目 ( Y5573162)双波长法快速测定

7、蛋白质含量 3but not t he absorbance of 590nm ,and replace t he UV/ V IS spect rophotometer wit h t he microplate au2t he sensitivit y of t he assay about 20 - fold ,also make a lot of samples be detected in one cycle. Conclu2而当它与蛋白质结合时变成兰色。因此考马斯1. 2染料的配制 :将 100mg考马斯亮兰溶解在灵5540分光光度计厂 , 752C)在 460 700nm波长内

8、,每10nm检测样品的透光率 ,换算成吸收度 ,根据吸收度 -波长绘制吸收光谱图。1. 4蛋白质测定 :方法同上 ,样品和染料用量减少1/ 4。用酶标仪 (Bio - Rad ,model550)代替紫外 -可见分光光度计作为检测仪 ,酶标检测板作为反应池 ,检测特定波长下不同蛋白浓度产生的吸收度。2结果2. 1吸收光谱 : 0. 8ml稀释的染料加入 0. 2ml5mg/ ml的牛血清蛋白 ,使考马斯亮兰完全与蛋白结合 ,在 360700nm内每相隔 10nm检测待定样品的吸收度。根据吸收度 -波长绘制考马斯亮兰 -蛋白质结合物吸收光谱 (图 la) ;以稀释的染料为待测样本 ,绘制游离考马

9、斯亮兰染料的吸收光谱 (图 lb)。ACTA ACADEMIA E MEDICINA E SU ZHOU 2000 ;20 (1)从吸收光谱图可知 ,考马斯亮兰 -蛋白质结合物的最大吸收波长为 590nm ,考马斯亮兰染料的最高吸收波长为 460nm ,590nm波长下游离考马斯亮兰染料也有较高的吸收度 ,而 460nm处染料 -蛋白质结合物无吸收度。2. 2蛋白质检测的线性范围 :为了适合酶标仪滤光片的检测 ,以 595nm和 450nm作为检测波长 ,将 BSA从 1mg倍比稀释至 240pg/ ml ,以检测样品在各浓度 C时的吸收度。分别以 A595 - C ,A450 - C和 A5

10、95/ A450 -C作图 ,观察单波长吸收度和双波长吸收度之比与蛋白质浓度的线性关系。由图 2可知 ,A595和 A595/ A450在一定范围内和蛋白质浓度成正比关系 ,A450和蛋白质浓度无正相关。A595/ A450在线性范围内随蛋白质浓度的变化比 A595灵敏。为了明确 A595/ A450双波长法检测范围 ,通过局部放大作图 3。苏州医学院学报 2000 ;20 (1)41从图 3a、3b可知 ,A595/ A450双波长法最高检测上限的蛋白质浓度为 32. 25g/ ml ,最低检测下限为0. 122g/ ml ;同理作图 3c、3d ,A595单波长检测上限为 7. 81g/

11、ml ,最低检测下限为 0. 976g/ ml。2. 3标准曲线 :在检测限范围内 ,以蛋白质浓度 C为横坐标 ,吸收度 A为纵坐标作标准曲线图。A595/A450 - C直线关系为 y = 0. 2011x + 1. 0395 ,相关系数 r2 = 0. 9965 ;A595 - C直线关系为 y = 0. 0258x +0. 4859 ,相关系数 r2 = 0. 9951。表明单、双波长测定法在检测限内其吸收度与蛋白质浓度呈良好线性关系。的人为影响因素。而采用酶标仪作检测仪 ,所需样3讨论本实验结果证实 ,在考马斯亮兰法测定蛋白质含量时 ,采用双波长测定法其灵敏度可提高至0. 122g/

12、ml ,为单波长测定法灵敏度 ( 0. 976g/ ml )的 8倍。虽然单波长和双波长法之间线性相关系数差别不大 ,但双波长测定法比单波长测定法具有更宽线性测量范围。双波长测定法比单波长测定法定灵敏度高 ,主要是由于双波长法不但反映了考马斯亮兰-蛋白质结合物的吸收度 ,而且也反映了游离染料的吸收度。在测定过程中随着蛋白质浓度的增加 ,游离考马斯亮兰染料逐渐减少 ,因此在蛋白质浓度发生改变时 ,不但染料 -蛋白质结合物在 595nm的品仅 100l或更少 ,而且一次可检测大量的标本 ,过程自动化程度较高 ,适用于样品体积较少和大量样品的检测。单波长 -酶标法灵敏度为 0. 976g/ ml ,

13、而传统考马斯亮兰灵敏度为 2g/ ml ,可见减少误差会提高实际测量的灵敏度。本实验室多次使用证实 ,通过双波长和酶标法相结合应用于考马斯亮兰蛋白质定量 ,不但克服了传统考马斯亮兰蛋白定量灵敏度低、线性范围小 ( 210g/ ml)缺点 ,而且使定量过程更加快速、简单和重复性好。这种方法上的略为改进 ,使考马斯亮兰法可广泛适用于各种要求的蛋白质定量检测。吸收度发生改变 ,而且游离考马斯亮兰染料在参考文献595nm的吸收度也要发生变化 ,所用单采用 595nm波长的吸收度不能确切反映染料 -蛋白质浓度的变化。在 450nm波长时 ,其吸收度 A在一定范围内随蛋白质浓度呈负相关 ,主要是因为随着蛋

14、白质浓度的增加 ,游离染料逐渐减少 ,所以 A595/ A450随蛋白质浓度变化的灵敏性比 A595更明显 (图 4)。在传统考马斯亮兰测定蛋白质含量时 ,通常以可见 -紫外分光光度计作为检测仪 2 。其检测池所需样品体积至少 1ml ,因此所需的检测样品较多 ,浪费较大。传统分光光度法在检测过程中 ,需不断清洗样品池和重复检测过程 ,其重复性劳动性多 ,易出现操作错误 ,增加了实验的系统误差和可能出现1Kirazov L P , Venkov L G , Kirazov EP. Comparison of t heLowry and t he Bradford protein assays as applied for proteinestimation of membrane - containing fractions. AnalBiochem ,1993 ,208 (1)442Gasparov VS ,Degtiar V G. Protein determination by bindingwit h t he dye Coomassie brilliant blue G - 250. Biokhimiia ,1994 ,59 (6)763terference in t h