SOD检测波长的选择及含量测定ppt课件

1、实验七实验七 SODSOD检测波长的选检测波长的选择及含量测定择及含量测定一、超氧化物歧化酶的基本特性一、超氧化物歧化酶的基本特性及生理功能及生理功能1 1、超氧化物歧化酶的组成、超氧化物歧化酶的组成 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶Superoxide Superoxide Dismutase, SODDismutase, SOD是一种能催化超氧阴离是一种能催化超氧阴离子自由基发生歧化反应的金属酶，按金属子自由基发生歧化反应的金属酶，按金属辅基不同分为三类：辅基不同分为三类： Cu,Zn-SOD Mn-SOD Fe-SODCu,Zn-SOD Mn-SOD Fe-SOD 自由基：是一类非常活跃的化

2、学物质，人自由基：是一类非常活跃的化学物质，人体正常的新陈代谢就会产生自由基、是人体正常的新陈代谢就会产生自由基、是人体活动所需要的，但在某些特殊的情况下，体活动所需要的，但在某些特殊的情况下，体内会产生过量的自由基。它可聚集体在体内会产生过量的自由基。它可聚集体在人体各组织器官上，导致各种慢性病与老人体各组织器官上，导致各种慢性病与老化，故说它是化，故说它是 万病之源万病之源 ，是人体健康的，是人体健康的大敌。大敌。 2 2、超氧化物歧化酶的生理功能、超氧化物歧化酶的生理功能（1 1延缓由于自由基侵害引起的衰老现象延缓由于自由基侵害引起的衰老现象（2 2治疗由自由基损伤而诱发的疾病治疗由自由

3、基损伤而诱发的疾病（3 3消除肌肉疲劳消除肌肉疲劳（4 4提高人体的抵抗力提高人体的抵抗力蛋白质含量测定方法蛋白质含量测定方法t定氮法定氮法t紫外分光光度法紫外分光光度法t双缩尿法双缩尿法BiuretBiuret法）法） tFolinFolin酚试剂法酚试剂法LowryLowry法）法） t考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法BradfordBradford法）法）t 其中其中BradfordBradford法和法和LowryLowry法灵敏度最高，比紫外法灵敏度最高，比紫外吸收法灵吸收法灵10102020倍，比倍，比BiuretBiuret法灵敏法灵敏100100倍以上。定倍以上。定氮法虽然比较复杂，但

4、较准确，往往以定氮法测定的氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑的几点因素在选择方法时应考虑的几点因素 实验对测定所要求的灵敏度和精确度；实验对测定所要求的灵敏度和精

5、确度； 蛋白质的性质；蛋白质的性质； 溶液中存在的干扰物质；溶液中存在的干扰物质； 测定所要花费的时间。测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法BradfordBradford法），由于其法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。突出的优点，正得到越来越广泛的应用。一、紫外分光光度法一、紫外分光光度法 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在高峰在280nm280nm处，其吸光度与蛋白质含量成正比。此外，蛋处，其吸光度与蛋白质

6、含量成正比。此外，蛋白质溶液在白质溶液在238nm238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。可以进行蛋白质含量的测定。 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用

7、测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。物质，会出现较大的干扰。 二、双缩脲法二、双缩脲法BiuretBiuret法）法） 双缩脲NH3CONHCONH3是两个分子脲经180左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基（-CONH2或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与

8、蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定波长为540nm，测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。三、三、FolinFolin酚试剂法酚试剂法LowryLowry法）法） 此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。

9、此复合物将Folin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐还原，产生深兰色钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。 这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。 此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。 此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20-250mg。四、考马斯亮兰法四、考马斯亮兰法BradfordBradford法）法） 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突

10、出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸特别是精氨酸和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。1.SOD1.SOD检测波长的确定检测波长的确定准确称取准确称取SODSOD粉末粉末10mg10mg，用，用0.15mol/L NaCl0.15mol/L NaCl配制配制成成1mg/ml1mg/ml蛋白溶液，作为标准储备液蛋白溶液，作为标

11、准储备液。从上述储备液从上述储备液中吸取两份，每份中吸取两份，每份0.4ml0.4ml，分别，分别放置在试管中，其中一份加入放置在试管中，其中一份加入0.15mol/L NaCl 0.15mol/L NaCl 溶液溶液5ml5ml，摇匀后备用；另一份中先加入，摇匀后备用；另一份中先加入0.15mol/L NaCl 0.15mol/L NaCl 溶液溶液0.6ml0.6ml，再加入，再加入5ml5ml考马考马斯亮兰试剂，斯亮兰试剂，1h1h内以内以0.15mol/L NaCl 0.15mol/L NaCl 溶液为溶液为空白分别进行全波长扫描，并记录最大吸收波空白分别进行全波长扫描，并记录最大吸收

12、波长。长。2. SOD2. SOD标准曲线的制作标准曲线的制作 t取已配制好的标准储备液取已配制好的标准储备液备用。取备用。取6 6支试管，按下表操作。支试管，按下表操作。试管编号试管编号 0 01 12 23 34 45 51mg/ml SOD1mg/ml SOD溶液溶液 /ml /ml 0 00.20.20.30.30.40.40.50.50.60.60.15mol/L NaCl 0.15mol/L NaCl /ml /ml 1.01.00.80.80.70.70.60.60.50.50.40.4考马斯亮兰试剂考马斯亮兰试剂 /ml /ml 5ml5ml摇匀，摇匀，1h1h内以内以0 0号试管为空白对照，在号试管为空白对照，在595nm595nm处比色处比色 3. 3. 样品测定样品测定 精密吸取精密吸取1mg/ml 1mg/ml 的的SODSOD溶液溶液0.35ml0.35ml，再加入，再加入0.65ml