【医院】HE技术操作规范

1、HEHE技术操作规范技术操作规范第一步：固定 固定能防止组织自溶及腐败，尽量保持组织原貌 固定液通过以下机制稳定蛋白： 相互交联：甲醛与蛋白质交联 蛋白沉淀：蛋白变性沉淀 合理固定很重要，为了： 防止组织在处理中受损 经处理组织能易于切片固定不当的后果 固定不当会导致手工及自动IHC及ISH检测结果出现片状或不正常染色，从而影响免疫组化检测结果判定 固定不全过程固定不全过程 交联过程发生较慢，很易逆转 若固定时间过短，会发生交联不全，组织将被下一步的乙醇固定 经乙醇沉淀的蛋白其抗原结构会改变，因而不适用于IHC及ISH检测 固定过度固定过度 固定时间过长可能导致假阴性检测结果 过度多聚化阻止了

2、抗原暴露，因而影响抗原修复影响固定的因素 组织类型 从标本手术切除至开始固定的时间 待检标本的体积及厚度 固定液类型 （10%福尔马林） 固定液与组织体积比 （至少10：1） 固定的时间 温度从标本离体到开始固定的时间 为防止组织自溶，待检组织从手术离体至开始固定之间的时间应尽可能短 乳腺癌最多 1小时 胃癌应控制在 2030 分钟内固定液种类 推荐10%中性缓冲福尔马林（中性缓冲福尔马林（NBF）作为乳腺癌及胃癌组织的固定液（IHC或ISH） 10% NBF等同于4%甲醛溶液 交联简单的固定液 应使用新鲜福尔马林溶液，福尔马林贮备液应： 定期更换 （最多贮存6个月） 室温贮存 标记生产日期或

3、稀释浓度以及过期日期固定不当会导致手工及自动IHC及ISH检测结果出现片状或不正常染色，从而影响免疫组化检测结果判定固定时间 乳腺组织 用于HER2检测的手术切除组织样本(IHC或ISH检测)，一般固定648小时 胃组织 手术切除及活检组织样本，一般固定848小时 固定时间取决于待检组织类型固定时间取决于待检组织类型-组织取样手段，组织厚度及固定液组织取样手段，组织厚度及固定液 不同的检测程序应使用优化的相应固定时间不同的检测程序应使用优化的相应固定时间第二步取材 组织块的面积通常为，厚度不超过。太大太厚的组织块常会固定不充分，而影响脱水和制片。 第三步：脱水 目的：因为石蜡不溶于水，所以需从

4、组织中除去水分 梯度脱水：75%，85%、95%，100%乙醇 若无乙醇，其他溶剂例如异丙醇亦可用于脱水第四步：透明 因乙醇和石蜡不相溶，所以需用另外一种溶剂因乙醇和石蜡不相溶，所以需用另外一种溶剂 用于透明的溶剂既能同乙醇混溶，又能与石蜡混溶 常用透明剂包括： 二甲苯 L苧烯 氯仿 松节油（TO） 使用“透明”该词是因组织会变为透明第五步：浸蜡 浸蜡过程中，液体石蜡代替透明液以利于进行超薄切片 推荐使用溶点为5658oC的新鲜石蜡 应避免浸蜡时间过长 经合理石蜡包埋的乳腺及胃组织在进行切片之前，可在室温下(2025oC)无限期地贮存组织处理仪 影响组织处理的因素 热 增加浸润速率 真空 有助

5、去除:残余空气之前溶剂 压力 起搅拌作用第六步石蜡包埋 将需要切片的面靠近包埋盒 小组织尽量聚集在一起 注意管腔、皮肤等组织的位置第七步切片 切片机的种类 直推式 轮转式 切片的方式 干切 湿切 切片厚度会影响显色及检测数据分析 组织切片厚度标准 35 m. 可用经校准过的超薄切片机切片 切片需贴在粘合性强的载玻片上 (可使用经多赖氨酸防脱片处理的玻片)，贴片后将载玻片置于室温下风干12-24小时或于60烘干1小时 经多赖氨酸防脱片处理的玻片 厂商试剂盒及/或自动化染色平台需配合指定玻片使用 最好在HER2免疫组织化学染色检测前才开始切片 如果过早切片，让切片暴露在室温太久，容易造成组织细胞抗

6、原性受损 应尽可能在切片后两星期内进行染色 切片最长保存期为4-6星期 切片应从以下细胞组织区域提取 乳腺内的侵袭性癌细胞组织 食管及胃交界癌的代表性癌细胞组织 例如混合癌中的胃腺癌组织区域及非坏死或无感染区域第八步捞片 用玻片从冷水盆上捞起蜡片，后把蜡片放在50上清水上展平并捞起切片第九步烤片 常用温度60-70 烤片时间：最少30分钟 57 过夜 温度过高、时间过长会导致蛋白变性温度过高、时间过长会导致蛋白变性 温度过低、时间过短烤片不充分、石蜡不溶，拖拉不彻底温度过低、时间过短烤片不充分、石蜡不溶，拖拉不彻底第十步脱蜡至水 用二甲苯(或二甲苯代替品)为石蜡切片脱蜡，再用无水乙醇梯度稀释液

7、回水 石蜡必须彻底清除，否则将影响染色，减低特异性染色及提高非特异性背景染色步骤取一黏有石蜡切片的载玻片，在室温下依序作以下操作：放在二甲苯I中浸泡10分钟 放在二甲苯II中浸泡10分钟 放在100%乙醇中浸泡两次，每次30秒 放在95% 乙醇中浸泡两次，每次30秒 放在80%乙醇中浸泡一次，每次30秒 放在75%乙醇中浸泡一次，每次30秒 蒸馏水洗在纸巾上轻敲载玻片沥干多余的缓冲液，用吸水纸抺干组织周围第十一步：HE染色（苏木素-伊红染色） 原理 利用细胞内外的酸碱度与苏木素、伊红进行化学反应；即细胞核（酸性）与碱性苏木素进行反应形成蓝色；细胞质（碱性）与酸性伊红进行反应形成红色。步骤 二甲苯I、II各10min 100%酒精I、II，95%酒精I、II，80%酒精，蒸馏水各1min。 苏木精染液15min，流水冲洗。 0.5%盐酸酒精分化5s，流水冲洗1min。 饱和碳酸锂水溶液1min，流水冲洗10min。 1%伊红染液染40s，水洗 。 80%酒精，95%酒精I、II，80%酒精，100%酒精I、II。 二甲苯I、II各1min 。第十二步：封片 封片剂：中性树胶、甘油等重要重要提示提示 注意在任何情况下都不能让组织干透 尽量减少封片液用量染片结果 细胞核成蓝色细胞核成蓝色 细胞质成红色细胞质成红色 红蓝对比