诺百文库服务

1、1Novobio Custom ServicescDNA文库服务Feb 2012C 1. 文库概述文库概述cDNA Library定义：定义：A cDNA library refers to the complete, or nearly complete, set of all mRNAs contained with a cell or organismA cDNA library will contain a stable representation of the mRNA present in a specific tissue at the time of collectioncD

2、NA Library服务的目的：服务的目的：To isolate or preserve a gene of interest, for example a novel or disease genecDNA libraries allow the study of tissue specific gene expressioncDNA sequences gives the genetic relationship between organisms through the similarity of their DNA注：注： cDNAcDNA文库仅包含正在表达的基因文库仅包含正在表达的基

3、因 不同物种、不同组织的不同物种、不同组织的cDNAcDNA文库不相同文库不相同从基因库中筛选、分离基因，可据对待选基因从基因库中筛选、分离基因，可据对待选基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和条件。相关信息的了解程度，确定筛选方法和条件。常用方法是利用一段核苷酸序列常用方法是利用一段核苷酸序列(DNA，cDNA或寡核苷酸或寡核苷酸)作作探针探针(probe)，用放射性同位素或非，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库。选基因库。文库应用文库应用 - 筛选、分离基因筛选、分离基因平板杂交筛选平板杂交筛选克隆DNA转移到尼龙

4、膜上；膜上的DNA在碱性条件下变性，解聚形成单链；再通过烤膜或紫外线照射，单链将与膜紧密结合；再将膜置于含有放射性标记的核酸探针的溶液中保温，使探针与其互补序列进行杂交；杂交后充分洗去未杂交的探针，然后可由放射性自显影鉴定。寡聚核苷酸探针寡聚核苷酸探针抗体探针抗体探针 表达筛选 通过抗体筛选来检测cDNA编码的蛋白质cDNA文库构建的简明流程文库构建的简明流程以组织细胞中的以组织细胞中的mRNAmRNA为模板，反转录合成双链为模板，反转录合成双链cDNA cDNA ，各，各cDNAcDNA分子分别插入载体分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。m

5、RNA isolation, purificationCheck the RNA integrityFractionate and enrich mRNASynthesis of cDNA Treatment of cDNA endsLigation to vector2. 文库要点文库要点Every good cDNA library has three key characteristics that Every good cDNA library has three key characteristics that distinguish it from mediocre counter

6、parts:distinguish it from mediocre counterparts:It is large enough to contain representatives of all It is large enough to contain representatives of all sequences of interest, some of which may be derived from sequences of interest, some of which may be derived from low-abundance mRNAs.low-abundanc

7、e mRNAs.QC: Total cfu; % recombinants2. It includes a minimal number of clones that contain small 2. It includes a minimal number of clones that contain small (often defined arbitrarily as 500 bp) cDNA inserts.(often defined arbitrarily as 500 bp) cDNA inserts.QC: AIS Average Insert Size3. It is com

8、posed of cDNA inserts that are near full-length 3. It is composed of cDNA inserts that are near full-length copies of the mRNAs from which they were derived.copies of the mRNAs from which they were derived. QC: % Full Length (序列分析测序结果，看是否有完整ORF) N 所需克隆数 P 要求的概率（0.99） 1/n 某一稀有mRNA在总mRNA中比例 如人约3万基因，约1

9、0万mRNA，要求某一单拷贝基因在文库中出现的概率为0.99时，文库的库容量最小是多少？ 文库文库QC - cfu文库文库QC Total cfu倍比稀释, 涂LB平板，LB平板计数克隆形成数文库文库QC % recombinants & AIS随机挑取文库中的克隆，抽提质粒，进行PCR，以鉴定插入片段大小文库文库QC % Full Length随机挑取文库中的克隆，进行测序 根据测序结果，进行ORF的预测，并结合核苷酸和预测蛋白序列搜索NCBI数据库以确定cDNA的全长。 ORF在线预测软件：/gorf/gorf.html BLAS

10、TN和BLASTP：/Blast.cgi 13构建文库的要点构建文库的要点1. 1. 获得数量足够的、高质量的起始获得数量足够的、高质量的起始RNARNA 细胞，组织的收集，保存以及运送 推荐采用纯化mRNA后进行反转录（总mRNA在0.5-2微克左右）2. 2. 反转录成功与否及反转录效率反转录成功与否及反转录效率3. cDNA3. cDNA产物的分级处理产物的分级处理 层析柱回收效率高，不易损失低拷贝cDNA 胶回收适合于富集特定大小的cDNA片段4. 4. 载体与载体与cDNAcDNA的连接效率的连接效率 cDNA末端的处理5. 5

11、. 连接产物转化大肠杆菌的效率连接产物转化大肠杆菌的效率 电转 高效率感受态细胞要点总要点总RNA的的QC要点要点mRNA的纯化的纯化Effect of RNase H on Reverse TranscriptionAAAAAAAAAAAAAA-AATTTTTTTTTTTTTmRNAcDNAPolRNase HAAAAAAAAAAAAAA-AATTTTTTTTTTTTTmRNAcDNAPolRNase H degrades template, causing truncation of cDNAReduction of RNase H allows higher yields of full

12、-length cDNASuccess with RNA secondary structure at high temperatures2 g total rat brain RNA for the Dynein (12.3 kb)1 g total HeLa RNA for the other primers (GSP) 200 units of SuperScript III, 50 min at 42 C, 50C or 55C. Amplification Enzyme: Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity4242 C C5050 C

13、C5555 C CD yn 12. 3 kbCH 9. 3 kbPol E 6. 8 kbRA D 5. 6 kbcD N A synt hesi s t em perat ureM MHigh Temp RT Enable:Melting 2nd structureIncreasing specificityIncreasing YieldHigher Incubation Temperature3. Types of cDNA Libraries 常规文库常规文库 Full-length cDNA enriched technology 5 cap full-length enriched

14、 Normalization technology Reduce abundant genes up to 100-fold and enrich rare genes 2-3 fold Subtracted Library Isolate genes up or down-regulated in one sample compared to another3.1 常规文库常规文库 - Uncut LibraryUtilize high efficiency Gateway cloningEfficient cDNA cloning (5-10 x106 clones) 95% recomb

15、inant clones More full-length clones (No restriction enzymes required)Y2H library酵母双杂交技术酵母双杂交技术是发现和研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的重要技术平台。通过酵母双杂交筛选到的相互作用蛋白，反映了它们有可能共同参与某些生命活动的过程。在酿酒酵母中检测相互作用在酿酒酵母中检测相互作用基于基因表达调控的机理基于基因表达调控的机理：酵母转录因子GAL4的DNA结合功能域（DBD）和转录激活结构域（AD）在分开时不能激活转录；当被分开的两者通过适当的途径在空间上接近时，重新呈现完整的GAL4转录因子活性，使启动子

16、下游基因得到转录。21酵母双杂交系统的主要成分酵母双杂交系统的主要成分应用类型应用类型分析两个蛋白或蛋白结构域之间的相互作用（分析两个蛋白或蛋白结构域之间的相互作用（testing two-hybrid interactions）1. 从文库中筛选与已知蛋白有相互作用的蛋白（从文库中筛选与已知蛋白有相互作用的蛋白（forward two-hybrid library screen）双载体双载体1）Bait质粒2）Prey质粒或者双杂交文库SMART cDNA librarysmartsmart文库构建技术文库构建技术gatewaygateway文库构建技术文库构建技术技术特性技术特性利用pcr

17、合成cDNA第二链；cDNA双链通过酶切连接进入克隆载体用polymerase延伸合成cDNA第二链（非pcr）；cDNA双链通过gateway重组进入克隆载体（无需酶切）样本需求样本需求较少一般库容量库容量1-3*1065-10*106（明显优于smart方法）酶切问题酶切问题采用内切酶，长片段基因可能被切开采用Invitrogen专利的Gateway位点特异性重组技术，不使用限制性内切酶切割等步骤，无需担心任何基因被剪切片段长度片段长度较短（采用的pcr方法更有利于小片段dna的富集）较长（不采用pcr方法，不会造成小片段的富集效应）SMART方法利用了逆转录酶内源的末端转移酶活性SMAR

18、T：逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo（dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端3.2 Full Length EnrichmentProprietary cap-site binding ligand used to enrich for full-length cDNAsFull length cDNA libraries routinely achieve 65-85% full-length clones3.3 Normalized Libraries 真核生物的基因组 表达的基因数 10,000 50,000 基因的丰度（拷贝数） 1200,000 10-20 个 高丰度基因 几千个拷贝以上 几百个 中丰度