水稻显性早熟基因Ef-cd的分离鉴定和早熟效应分析

1、中国农业科学 2005,38(5:859-864 Scientia Agricultura Sinica收稿日期：2004-07-30基金项目：国家自然科学基金资助（30070469） 作者简介：邓晓建（1962-），男，湖南邵阳人，研究员，博士，主要从事水稻遗传育种与分子生物学方面的研究。邓晓建和杨志荣为通讯作者，Tel Fax E-mail ：dengxj水稻显性早熟基因Ef-cd 的分离鉴定和早熟效应分析邓晓建1,2，王平荣1，李秀兰1，董春林1，杨志荣2（1四川农业大学水稻研究所，成都 611130；2四川大学生命科学学院，成都

2、610064）摘要：Ef-cd 基因是位于水稻第3染色体短臂上的一个显性早熟基因。本研究以早籼核不育系6442S-7为Ef-cd 基因的供体亲本，通过连续回交与自交以及分子标记辅助选择，分离了Ef-cd 基因，分别构建了以迟熟籼稻品系明恢63、蜀恢881和蜀恢527为受体亲本（遗传背景）的近等基因系，并在此基础上探明Ef-cd 基因在纯合及杂合状态下一般可使水稻提早抽穗1114 d。Ef-cd 基因对促进水稻早熟与高产的有机结合，快速、高效培育出早熟超高产新品种具有重要意义。关键词：水稻；生育期；早熟性；显性早熟基因；基因效应Isolation, Identification and Earl

3、iness Effect Analysis of RiceDominant Earliness Gene Ef-cdDENG Xiao-jian1,2, WANG Ping-rong1, LI Xiu-lan1, DONG Chun-lin1, YANG Zhi-rong 2(1 Rice Research Institute, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130;2 College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064 Abstract: Ef-cd gene is

4、 a dominant earliness gene located on the short arm of rice chromosome 3. In this paper, through continuous backcross, self-pollination and molecular marker assisted selection, individual Ef-cd gene was isolated and nearly isogenic early-maturing lines were constructed by using a genic male-sterile

5、and early-maturing indica line 6442S-7 as donor, and late-maturing indica lines Minghui 63 (MH 63, Shuhui 881 (SH 881 and Shuhui 527 (SH 527 as recipients (genetic background, respectively. Further, it was found out that Ef-cd gene could generally advance rice to head 11-14 days earlier. So, it is c

6、onsidered that Ef-cd gene has an important role in rapid developing early-maturing and super high-yielding rice varieties.Key words: Rice; Growth season; Earliness; Dominant earliness gene; Gene effect中国及世界稻作分布十分广泛，生态条件复杂，耕作制度多种多样，各地对品种生育期的要求不同。另一方面，不少研究和实践表明，随着品种生育期的缩短，水稻生物学产量和经济产量可能降低，但并非呈线性关系。因此，

7、培育优良早熟品种，可满足许多生态地区和生产季节的需要，并获得高产稳产，这对水稻生产具有十分重要的意义。水稻的早熟性一般由隐性主基因和/或微效多基因控制，显性早熟基因报道较少。Tsai 首先在粳稻上发现显性早熟基因Ef-1，它位于第10染色体，可使水稻抽穗期提早10 d左右13。Sato 等人在粳稻上发现显性早熟基因Ef-x ，它位于第2染色体，该基因本身的早熟效应较小且对温度敏感，但与Ef-1基因结合、共同起作用时早熟效应显著增加且对温度不敏感4。邓晓建等人首次发现早籼核不育系6442S-7具有完全显性早熟特性，该特性由2对显性早熟基因控制，并利用AFLP 、RAPD 、SSR 和RFLP 等

8、4种分子标记将其中的1对显性早熟基因Ef-cd 定位于第3染色体短臂，与微卫星标记RM231的遗传距离为6.7 cM5,6。本研究通过连续回交与自交以及分子标记辅助选择，分离了Ef-cd 基因，构建了近等基因系，并在此基础上分析了该基因的早熟效应，以期为该基因的分子克860 中 国 农 业 科 学 38卷隆和育种应用奠定基础。1 材料与方法1.1 植物材料早籼不育系6442S-7、珍汕97A （珍汕A ）、冈46A 、D702A 和金23A ，以及中籼迟熟品系明恢63、蜀恢881、蜀恢527、明恢86和9311。 1.2 Ef-cd 基因的分离、检测及近等基因系构建19982002年在四川成都

9、和海南陵水以6442S-7为早熟基因供体亲本，明恢63、蜀恢881和蜀恢527为受体亲本，进行杂交、连续回交和自交。在自交分离世代，对早熟与迟熟植株数呈31分离的株系，分单株取叶片提取DNA ，用与Ef-cd 基因连锁的微卫星标记RM231进行检测，鉴定该株系中显性早熟基因是否为Ef-cd 基因。对鉴定为Ef-cd 基因的株系，选早熟植株连续自交，或选早熟植株继续与受体亲本回交若干代，然后再连续自交，直至获得整齐一致的早熟近等基因系。 1.3 早熟效应观察2003年在四川成都春夏季（自然长日条件）和2002/2003年在海南陵水冬春季（自然短日条件）分别种植早熟近等基因系（包括原始受体亲本），

10、每个材料40株。同时，将早熟近等基因系分别与不同熟期的测交品种（早籼不育系和中籼迟熟品系）杂交，在四川成都种植F 1代，每个材料2060株。隔日逐株观察记载始穗期，以每株主穗抽出1 cm作为该株始穗的标准，以播种到始穗的平均天数作为抽穗期。 1.4 水稻叶片DNA 的提取和微卫星分析水稻叶片DNA 提取参照McCouch 等人的方法7。微卫星分析按Panaud 等人和Chen 等人的方法8,9，扩增产物用3.0%3.5%琼脂糖凝胶电泳。2 结果与分析2.1 Ef-cd 基因的分离与鉴定将早熟基因供体亲本6442S-7与受体亲本明恢63、蜀恢881和蜀恢527进行杂交、连续回交和自交，对B 5F

11、 2和B 4F 2等自交分离群体的抽穗期进行逐株调查，并对早熟与迟熟植株数呈31分离的株系，用Ef-cd 基因的连锁标记RM231进行检测，结果有63-3、63-5、881-3、881-5、881-7和527-5等6个株系（分离群体）的显性早熟基因为Ef-cd 单基因，其特征是（图1，表1）：（1）抽穗期呈典型的双峰分布，峰谷十分明显；（2）早熟与迟熟植株分离比，经2测验符合31；（3）RM231带型与抽穗期的早或迟呈现明显的共分离。此外，也检测到一些呈31分离的株系，其RM231带型无分离，早熟和迟熟植株都是迟熟亲本（受体亲本）的带型，表明这些株系在多次回交过程中早熟亲本6442S-7的带型

12、已发生交换。对这些株系，用RM231不能鉴别其显性早熟基因是Ef-cd 基因还是6442S-7的另一个显性早熟基因。 2.2 Ef-cd 基因的早熟效应分析对63-3、63-5、881-3、881-5、881-7和527-5等6个被鉴定为只携带Ef-cd 单基因的株系，选早熟植株连续自交，或选早熟植株继续与受体亲本回交若干代，然后再连续自交，相应地获得了E63-3、E63-5、E881-3、E881-5、E881-7和E527-5等6个遗传稳定的早熟株系群（近等基因系）。分别种植这些早熟株系群及其原始受体亲本明恢63、蜀恢881和蜀恢527，结果表明， 图1 6个B 5F 2和B 4F 2代株

13、系（组合名称见表1）的抽穗期分布Fig.1 Distribution of heading dates in six B5F 2 and B4F 2 breeding lines (Combination name is as Table 15期 邓晓建等：水稻显性早熟基因Ef-cd 的分离鉴定和早熟效应分析 861表1 6个B 5F 2和B 4F 2代株系的抽穗期和微卫星标记RM231的分离Table 1 Segregation of heading dates and SSR marker RM231 in six B5F 2 and B4F 2 breeding lines抽穗期的分离（

14、植株数）Segregation of heading date (No. of plants微卫星标记RM231的分离(植株数Segregation of SSR marker RM231 (No. of plants 检测的早熟植株 Early heading plants detected 检测的迟熟植株Late heading plants detected不同带型 Different SSR pattern 不同带型 Different SSR pattern株系 Breeding line组合和世代 Combination and generation总数Total早熟 Early

15、heading迟熟 Late heading2(31总数 Total EE ELLL总数 TotalEE ELLL63-3 6442S-7/明恢63 B5F 2 6442S-7/MH 63 B5F 279 60 19 0.00420 7 112 14 0 3 1163-5 6442S-7/明恢63 B5F 2 6442S-7/MH 63 B5F 281 64 17 0.49821 7 131 13 0 1 12881-3 6442S-7/蜀恢881 B5F 2 6442S-7/SH 881 B5F 281 63 18 0.20221 8 130 15 0 0 15881-5 6442S-7/蜀

16、恢881 B5F 2 6442S-7/SH 881 B5F 280 62 18 0.15023 4 172 16 0 4 12881-7 6442S-7/蜀恢881 B4F 26442S-7/SH 881 B4F 280 58 22 0.15018 6 111 21 0 7 14527-5 6442S-7/蜀恢527 B4F 2 6442S-7/SH527 BF80 63 17 0.41722 6 15115 0 4 11EE. 早熟亲本6442S-7的带型；LL. 迟熟亲本明恢63、蜀恢881或蜀恢527的带型；EL. 早熟与迟熟亲本的杂合带型EE. SSR pattern of early

17、 heading parent 6442S-7; LL: SSR pattern of late heading parent MH 63, SH 881 or SH 527; EL. Hybrid pattern of early and lateheading parents在四川成都自然长日条件下，早熟株系的抽穗期为9196 d，比相应的原始亲本提早（缩短）1018 d，以株系群为单位的平均抽穗期为92.695.6 d，比相应的原始亲本提早11.416.5 d，平均13.1 d；在海南陵水自然短日条件下，早熟株系的抽穗期为8793 d，比相应的原始亲本提早1119 d，以株系群为单位的平

18、均抽穗期为88.692.4 d，比相应的原始亲本提早11.217.4 d，平均13.3 d（表2，图2-A 、图2-B ）。 同时，统计分析同一早熟株系群在二种日长条件下抽穗期提早（缩短）天数的差异，结果表明差异均不显著（表2），说明Ef-cd 基因可能是一个非感光的显性早熟基因。同时，从上述6个早熟株系群中分别选取E63-3-1、E63-5-2、E881-3-2、E881-5-1、E527-5-3和E527-5-6等6个有代表性的早熟近等基因系，将这6个早熟近等基因系及其原始受体亲本明恢63、表2 Ef-cd 早熟近等基因系的抽穗期Table 2 Heading dates of Ef-cd

19、 nearly isogenic early-maturing lines自然长日条件（四川成都，2003） Under long day condition (Sichuan, 2003 自然短日条件（海南陵水，2002/2003） Under short day condition (Hainan, 2002/2003抽穗期 Days to heading 抽穗期 Days to heading近等基因系Nearly isogenic lines (NILs世代Generation株系数No. oflines变幅 Range 平均 Average 缩短 Reduction 世代 Gener

20、ation 株系数No. of lines变幅 Range 平均 Average 缩短Reduction 长日与短日条件下抽穗期缩短的差异显著性SD明恢63 MH 63 3 109110109.3±0.4 1 106 106 E63-3 B6F 7 6 9293 92.8±0.416.5B 6F 6 5 8789 88.6±0.9 17.4ns明恢63及其近等基因系 MH 63 and its NILs E63-5 B5F 8 5 9596 95.6±0.513.7 B 5F 7 3 9192 91.7±0.6 14.3 ns 蜀恢881 SH

21、 881 3 106107106.3±0.6 2 104105 104.5±0.7 E881-3 B6F 7 5 9395 94.4±0.911.9 B 6F 6 5 9293 92.2±0.4 12.3 ns E881-5 B5F 8 89496 94.9±0.611.4 B 5F 7 7 9293 92.4±0.5 12.1 ns 蜀恢881及其 近等基因系 SH 881 and its NILsE881-7 B7F 5 8 9395 94.0±0.912.3 B 7F 4 7 9293 92.1±0.4 12

22、.4 ns 蜀恢527 SH 527 2 105106105.5±0.7 1 102 102 蜀恢527及其 近等基因系 SH 527 and its NILsE527-5 B5F 6 14 9194 92.6±0.912.9 B 5F 5 6 9091 90.8±0.4 11.2 ns 平均 Average 13.1 13.3SD. Significance of difference between reduction of heading dates under long day and short day conditions Ns. 在0.05水平上差异

23、不显著 No significance at 0.05 level862 中 国 农 业 科 学 38卷蜀恢881和蜀恢527分别与不同熟期的测交品种杂交，在四川成都种植F 1代，结果表明早熟近等基因系的测交F 1代抽穗期为9299 d，比相应原始亲本的测交F 1代提早（缩短）1014 d，平均11.4 d；以株系为单位的平均抽穗期为94.896.7 d，比相应原始亲本的测交F 1代提早10.913.0 d，平均11.6 d (表3，图2-C 。表3 Ef-cd 早熟近等基因系与不同熟期的测交品系杂交F 1代的抽穗期（四川成都，2003）Table 3 Heading dates (days

24、to heading of F1 progenies from Ef-cd nearly isogenic early-maturing lines crossed with tester lineswith various maturities (Sichuan, 2003测交品系 Tester lines被测近等基因系Nearly isogenic lines (NIL tested 明恢63 MH 63蜀恢881 SH 881明恢86MH 869311珍汕A ZS A冈46A G46AD702A金23A Jin 23A平均 Average缩短 Reduction明恢63 MH 63109

25、 107 107 107 107 108 106 107.3±1.0 E63-3-1 95 94 96 97 97 98 93 95.7±1.811.6 明恢63及其近 等基因系 MH 63 and its NILs E63-5-2 97 95 97 97 97 98 94 96.4±1.410.9 蜀恢881 SH 881 106 106 108 109 109 109 108 107.9±1.3 E881-3-2 94 94 97 98 99 99 95 96.6±2.211.3 蜀恢881及其 近等基因系 SH 881 and its N

26、ILs E881-5-1 94 94 97 99 99 99 95 96.7±2.411.2 蜀恢527 SH 527109 109 107 106 107.8±1.5 E527-5-3 97 97 97 94 96.2±1.511.6 蜀恢527及其 近等基因系 SH 527 and its NILsE527-5-6 96 96 95 92 94.8±1.913.0平均 Average 11.6 A. 左-蜀恢881，右-E881-3-2；B. 左-明恢63，右-E63-5-2；C. 左-汕优63(珍汕A/明恢63 ，中-Ef-cd 早熟汕优63(珍汕

27、A/E63-5-2，右-早熟杂交稻对照组合汕优64(珍汕A/测64A. SH 881 (left and E881-3-2 (right; B. MH 63 (left and E63-5-2 (right; C. Shanyou 63(ZS A/MH 63, left, Ef-cd early-maturing Shanyou 63(ZS A/ E63-5-2, medium, and early-maturing control hybrid combination Shanyou 64 (ZS A/Ce 64, right图2 同期播种的Ef-cd 早熟近等基因系与其原始受体亲本之间，以

28、及其测交F 1之间的抽穗期差异（当原始受体亲本及其测交F 1始穗时的植株形态比较）Fig.2 Difference of heading dates between an Ef-cd nearly isogenic early-maturing line and its original receptor parent, andbetween their tester F1 progenies (comparison of plant phenotypes when original receptor parents and their tester F1 progenies were hea

29、ding5期 邓晓建等：水稻显性早熟基因Ef-cd 的分离鉴定和早熟效应分析 863综合上述结果，认为Ef-cd 基因在纯合（近等基因系本身）和杂合（近等基因系测交F 1代）二种状态下一般可使水稻提早抽穗1114 d，少数可达1719 d。3 讨论抽穗期（或生育期）是水稻最重要的农艺性状之一，国内外对其进行了大量研究，已发现数十个控制抽穗期的主基因，包括感光基因、非感光基因及修饰基因16,10。近十年来，还利用DNA 分子标记发现并定位了数十个控制抽穗期的QTL 1120，其中在水稻第3染色体短臂上就定位了QHd3a 、Hd-4、Hd-5、hd3、dth3-1、dth3、dth3.1、Hd9等

30、多个QTL 1117。Lin 等人利用BC 4F 2群体，将Hd9作为单个孟德尔因子定位在水稻第3染色体短臂，与RFLP 标记S12021紧密连锁，并且，利用分子标记辅助选择构建了Hd9的近等基因系，探明Hd9在长日条件下可使水稻抽穗期延迟47 d，而在短日条件下则几乎保持不变17。Ef-cd 基因5,6与Hd9同位于第3染色体短臂靠近端部一侧，但表型效应完全不同，Ef-cd 基因在长日和短日条件下均使水稻抽穗期极显著提早，因此，Ef-cd 与Hd9应是两个不同的抽穗期基因。至于Ef-cd 和Hd9与上述位于第3染色体短臂的其它抽穗期QTL 的关系，尚需进一步研究。Tsai 首次在粳稻中发现位

31、于水稻第10染色体的显性早熟基因Ef-1，构建了以粳稻品种台中65为遗传背景的近等基因系，探明Ef-1基因可使水稻抽穗期提早10 d左右1,2。邓晓建等人则首次在籼稻中发现位于水稻第3染色体的显性早熟基因Ef-cd 5,6，本研究分离了Ef-cd 单基因，分别构建了以籼稻品种明恢63、蜀恢881和蜀恢527为遗传背景的近等基因系，探明Ef-cd 基因在纯合及杂合状态下一般可使水稻提早抽穗1114 d。中国杂交稻育种存在“高产不早熟，早熟不高产”的问题，影响了早熟杂交稻的进一步发展。如将Ef-cd 基因导入杂交稻亲本恢复系或/和不育系，可有两方面作用：(1一般认为杂种优势与双亲的遗传差异密切相关

32、，目前迟熟杂交稻产量潜力明显大于早熟杂交稻，其主要原因之一可能是迟熟杂交稻双亲遗传差异大于早熟杂交稻。利用Ef-cd 基因，可在保持迟熟杂交稻双亲遗传差异的同时，使生育期提早一个熟期，这对显著提高早熟杂交稻的产量潜力具有重要作用。(2中国育成了一大批迟熟的高产杂交稻（如广泛应用的高产组合汕优63及近年育成的重穗型超高产组合冈优527等），但这些组合在广大的早熟杂交稻地区（如长江流域双季晚稻区）不能应用。利用Ef-cd 基因，可使大批强优势的迟熟杂交稻组合迅速转化为超高产的早熟杂交稻新组合应用于生产，实现不同熟期间育种成果共享，提高育种成效。因此，利用Ef-cd 基因进行早熟杂交稻育种，有利于促

33、进早熟与高产的有机结合，快速、高效培育出早熟超高产杂交稻新组合。如冈优527（冈46A/蜀恢527）是1985年汕优63作对照以来四川省中籼迟熟组区试中率先达到8%以上增产幅度的一个突破性组合，将Ef-cd 基因导入其亲本恢复系蜀恢527，育成早熟冈优527，据初步试验，其抽穗期比冈优527提早12 d左右（表3），与早熟杂交稻对照组合汕优64和汕优77的抽穗期（分别为96和95 d）相当，但产量与冈优527差异不很显著，比汕优64和汕优77分别增产26.2%和15.9%。此外，一些优良的常规品种由于生育期过长，限制了推广应用，如将Ef-cd 基因导入这类品种，显著提早它们的熟期，可使它们适应

34、新的生态区域和生产季节，获得更广泛的生产应用。4 结论通过连续回交与自交以及分子标记辅助选择，从早籼核不育系6442S-7中分离了Ef-cd 单基因，构建了该基因的近等基因系，并在此基础上探明Ef-cd 基因一般可使水稻提早抽穗1114 d，少数可达1719 d 。认为Ef-cd 基因对促进水稻早熟与高产的有机结合，快速、高效培育出早熟超高产新品种具有重要意义。References1 Tsai K H. Studies on earliness genes in rice, with special reference toanalysis of isoalleles at the E loc

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