研8免疫印迹技术2剖析

1、免疫印迹技术免疫印迹技术Western Blot 凝胶电泳结束后，将凝胶上凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳分离到的蛋白条带通过转移电泳的方式转印至的方式转印至固相支持物固相支持物上上三、转膜三、转膜1.1.转印膜比较转印膜比较2.2.原理：将膜与胶放在中间，上下加滤纸原理：将膜与胶放在中间，上下加滤纸数层，做成数层，做成“Sandwich”Sandwich”样的转移单位，样的转移单位，并且保证带负电的蛋白质向阳极转移，并且保证带负电的蛋白质向阳极转移，即膜侧连接阳极或面向阳极（如图）。即膜侧连接阳极或面向阳极（如图）。v这种方法是用有孔的塑料和滤纸这种方法是用有孔的塑料和滤

2、纸将凝胶和将凝胶和PVDFPVDF膜夹成膜夹成“三明治三明治”形状，而后浸入两个平行电极中形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质在当的电泳方向就可以使蛋白质在电场力的作用下离开凝胶结合到电场力的作用下离开凝胶结合到PVDFPVDF膜上。膜上。(1)PVDF(1)PVDF膜和滤纸的预处理：剪裁适当大小膜和滤纸的预处理：剪裁适当大小的的PVDFPVDF膜，将其浸入甲醇液中浸泡膜，将其浸入甲醇液中浸泡10s10s（快速激活（快速激活PVDFPVDF膜），去离子水处理膜），去离子水处理5min5min，1 1转移缓冲液浸泡转移缓冲

3、液浸泡10min10min以上。以上。3.3.操作操作(2)(2)剪裁比膜略小的剪裁比膜略小的6 6层滤纸，用转移缓冲层滤纸，用转移缓冲液浸泡后待用。液浸泡后待用。(4)(4)转膜转膜 负极负极纤维帕纤维帕三层滤纸三层滤纸样品胶样品胶PVDFPVDF膜膜三层滤纸三层滤纸纤维帕纤维帕正极正极(5)(5)正确连接转移电泳连线，使电荷由负极正确连接转移电泳连线，使电荷由负极向正极流动。接通电源，恒流转膜向正极流动。接通电源，恒流转膜2h2h，2mA/cm2mA/cm2 2膜。此操作宜在膜。此操作宜在44冰箱中进行。冰箱中进行。(3)(3)取下电泳板，将其平置，去掉上层玻璃取下电泳板，将其平置，去掉上

4、层玻璃板，切除多余凝胶。板，切除多余凝胶。(6)(6)转膜完毕后小心取出转移膜，在转膜完毕后小心取出转移膜，在1 1TBSTTBST液中漂洗两次液中漂洗两次; ;(7)(7)将凝胶浸入考马斯亮蓝染液中，检查蛋将凝胶浸入考马斯亮蓝染液中，检查蛋白转移是否完全。（此步骤可省略）白转移是否完全。（此步骤可省略）(8)(8)转膜后检测：丽春红染膜（可省略）转膜后检测：丽春红染膜（可省略）四、封闭四、封闭1.1.目的：为避免作为检测试剂的特异性第目的：为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位异性背景提高，需对膜上的

5、潜在结合位点进行封闭处理。点进行封闭处理。2.2.封闭的原理：用非抗原的蛋白去封闭膜，封闭的原理：用非抗原的蛋白去封闭膜，避免抗体固定在非特异性膜上而引起高避免抗体固定在非特异性膜上而引起高背景。背景。3.3.可用的封闭剂：可用的封闭剂：（1 1）5%5%脱脂奶粉或脱脂奶粉或BSABSA（室温孵育（室温孵育1h1h）（2 2）Western Blot Western Blot 膜封闭液（生物试剂膜封闭液（生物试剂公司）公司）（3 3）Tween-20Tween-20：减少非特异性吸附，不：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。影响抗体与抗原的结合。五、一抗、二抗杂交五、一抗、二抗杂交v把把

6、NCNC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以膜面积以0.1mL/cm20.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育上平缓摇动，于室温孵育1-21-2小时或小时或44过夜。过夜。v回收一抗溶液，用回收一抗溶液，用TBSTTBST漂洗膜漂洗膜3 3次，每次次，每次10min10min。v加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育于室温孵育1-21-2小时或小时或44过夜。过夜。 v回收二抗溶液，用回收二抗溶液，用TBSTTBST漂洗膜漂洗膜3 3次，每次次，每次10min

7、10min。v最后用最后用TBSTBS漂洗膜漂洗膜2 2次，每次次，每次10min10min。六、检六、检 测测v根据标记根据标记AbAb2 2的标记物不同的标记物不同, ,其杂交其杂交的结果检测方法也不同的结果检测方法也不同, ,较常用的检较常用的检测系统有测系统有HRPHRP标记标记AbAb2 2的增强化学发的增强化学发光光(ECL)(ECL)和和DABDAB检测系统检测系统. .（1 1） 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶-DAB-DAB法法: :DABDAB显色液的配制显色液的配制: :按照按照1mlH1mlH2 2O O加显色剂加显色剂A,B,CA,B,C各各1 1滴滴, ,混匀混匀.

8、.显色显色: :将适量将适量DABDAB显色液平铺在显色液平铺在AbAb2 2杂交后杂交后（洗毕）的印迹膜上（洗毕）的印迹膜上, ,室温放置观察室温放置观察, ,可出现可出现明显的棕褐色蛋白显色带明显的棕褐色蛋白显色带终止终止: :用用Tris-HClTris-HCl缓冲液或水漂洗杂交膜即缓冲液或水漂洗杂交膜即可终止反应可终止反应. . （2 2） 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶-ECL-ECL法法: :增强化学发光增强化学发光(ECL)(ECL)检测是利用辣根过氧检测是利用辣根过氧化物酶催化化学发光物质化物酶催化化学发光物质, ,生成一种不稳生成一种不稳定的中间物质定的中间物质, ,其衰变时在暗室内形成明其衰变时在暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带显的肉眼可见的化学发光带, ,利用利用X X线胶线胶片感光原理片感光原理, ,将结果记录下来。将结果记录下来。 设计