紫外可见光分光光度法

1、1第一节第一节 电磁辐射及其物质的相互作用电磁辐射及其物质的相互作用 一、电磁辐射和电磁波谱一、电磁辐射和电磁波谱二、光学分析法的分类二、光学分析法的分类 三、光谱法仪器三、光谱法仪器分光光度计分光光度计21电磁辐射（电磁波，光） ：以巨大速度通过空间、 不需要任何物质作为传播媒介的一种能量 2电磁辐射的性质：具有波、粒二向性波动性：粒子性：cc1，chhEE，注：33电磁波谱：电磁辐射按波长顺序排列，称。射线射线 X 射线射线紫外光紫外光可见光可见光红外光红外光微波微波无线电波无线电波4常见的电磁辐射与物质作用的术语：常见的电磁辐射与物质作用的术语：吸收：是原子、分子或离子吸收光子的能量（等

2、 于基态和激发态能量之差），从基态跃迁至激发态的过程。发射：是物质从激发态跃迁回基态，并以光的形式释放出能量的过程。散射：没涉及能量的交换。拉曼散射：涉及能量的交换。折射、反射、干涉、衍射5（一）分类： 1光谱法：利用物质与电磁辐射作用时，物质内部 发生量子化能级跃迁而产生的吸收、发射或散射 辐射等电磁辐射的强度随波长变化的定性、定量 分析方法 62非光谱法：利用物质与电磁辐射的相互作用测定 电磁辐射的反射、折射、干涉、衍射和偏振等基 本性质变化的分析方法 分类：折射法、旋光法、比浊法、射线衍射法3光谱法与非光谱法的区别：7 原子光谱法原子光谱法：以测量气态原子或离子外层或内层：以测量气态原子

3、或离子外层或内层电子能级跃迁所产生的原子光谱为基础的成分分析电子能级跃迁所产生的原子光谱为基础的成分分析方法。方法。原子发射光谱法、原子吸收光谱法、原子荧光光谱原子发射光谱法、原子吸收光谱法、原子荧光光谱法以及法以及X射线荧光光谱法射线荧光光谱法分子光谱法分子光谱法：由分子中电子能级、振动和转动能级：由分子中电子能级、振动和转动能级的变化，表现形式为带光谱。的变化，表现形式为带光谱。红外吸收法、紫外红外吸收法、紫外-可见光吸收光谱法、分子荧光可见光吸收光谱法、分子荧光和磷光光谱法和磷光光谱法81分子吸收光谱的产生由能级间的跃迁引起能级：电子能级、振动能级、转动能级跃迁：电子受激发，从低能级转移

4、到高能级的过程转振电分EEEEchhE能级差92分子吸收光谱的分类： 分子内运动涉及三种跃迁能级，所需能量大小顺序 转振电EEE远红外吸收光谱红外吸收光谱可见吸收光谱紫外转振电mevEmevEmevE2525005. 0005. 025. 125105. 025. 106. 02013紫外-可见吸收光谱的产生 由于分子吸收紫外-可见光区的电磁辐射，分子中 价电子（或外层电子）的能级跃迁而产生 （吸收能量=两个跃迁能级之差）10（三）发射光谱（四）吸收光谱 光基态激发态释放能量发光hMM*发射光谱激发态光基态吸收辐射能量*MhM吸收光谱11主要特点：三个基本单元组成主要特点：三个基本单元组成12

5、13一、紫外-可见吸收光谱的电子跃迁类型 二、相关的基本概念三、吸收带类型和影响因素四、影响吸收带的因素五、朗伯比尔定律14预备知识：预备知识：COHnp p H15图示161. *跃迁：跃迁： 饱和烃饱和烃（甲烷，乙烷）（甲烷，乙烷） E很高，很高， n * * n*17图示18注：注：紫外光谱电子跃迁类型 ： n*跃迁 *跃迁 饱和化合物无紫外吸收 电子跃迁类型与分子结构及存在基团有密切联系 根据分子结构推测可能产生的电子跃迁类型； 根据吸收谱带波长和电子跃迁类型 推测分子中可能存在的基团（分子结构鉴定）191吸收光谱（吸收曲线）： 不同波长光对样品作用不同，吸收强度不同 以A作图 nex

6、t2吸收光谱特征：定性依据 吸收峰max 吸收谷min 肩峰sh 末端吸收饱和-跃迁产生20图示back213生色团（发色团）：能吸收紫外-可见光的基团 有机化合物：具有不饱和键和未成对电子的基团 具n 电子和电子的基团 产生n *跃迁和 *跃迁 跃迁E较低例： CC；CO；CN；NN 4助色团：本身无紫外吸收，但可以使生色团吸收 峰加强同时使吸收峰长移的基团有机物：连有杂原子的饱和基团例：OH，OR，NH，NR2，X225红移和蓝移： 由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基） 或采用不同溶剂后 吸收峰位置向长波方向的移动，叫红移（长移） 吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移（紫移，短移）6增

7、色效应和减色效应 增色效应：吸收强度增强的效应 减色效应：吸收强度减小的效应7强带和弱带： max104 强带 min102 弱带231R带：由含杂原子的不饱和基团的n *跃迁产生CO；CN；NN E小，max250400nm，max200nm，max10424 3B带：由 *跃迁产生芳香族化合物的主要特征吸收带 max =254nm，宽带，具有精细结构； max=200 极性溶剂中，或苯环连有取代基，其精细结构消失4E带：由苯环环形共轭系统的 *跃迁产生芳香族化合物的特征吸收带 E1 180nm max104 （常观察不到） E2 200nm max=7000 强吸收 苯环有发色团取代且与苯

8、环共轭时，E2带与K带合并 一起红移（长移）25图示26图示271、 由于立体阻碍，会影响共轭效应由于立体阻碍，会影响共轭效应立体阻碍立体阻碍282、 在有些在有些、不饱和酮中，虽然双键与酮基不产生共不饱和酮中，虽然双键与酮基不产生共轭体系，但由于适当的立体排列，使羰基氧的孤轭体系，但由于适当的立体排列，使羰基氧的孤对和双键的对和双键的电子发生作用，产生电子发生作用，产生R带。带。OCH2214nm 中强吸收带中强吸收带 284nm R带带SCOmax=238nm，max=253529非极性非极性 极性极性 COCOn p p p p 非非 极极 非非 极极n p p*跃迁跃迁：蓝移蓝移； ；

9、 p p p p*跃迁：跃迁：红移；红移； ； max(正己烷正己烷) max(氯仿氯仿) max(甲醇甲醇) max(水水)pp*230238237243np*3293153093053、 30溶剂效应1：乙醚2：水12250300苯酰丙酮 非极性 极性n p*跃迁：蓝移蓝移； ； p p*跃迁：红移； ；极性溶剂使精细结构消失；31OHOH-H+Omax=210.5nm，270nmmax=235nm，287nm32光的吸收基本定光的吸收基本定律- Lambert-BeerLambert-Beer定律 物理量:透光率及吸光度 Lambert-Beer定律 偏离Beer定律的因素 透光率的测量

10、误差33图1 光和物质发生作用示意图I入=I吸+I透+I反+I散I入=I吸+I透34透光率透光率：透过光的强度与入射光强度之比。0IIT T越大，物质对光的吸收越弱;反之,越强。吸光度吸光度：反映物质对光的吸收强弱的物理量。TATlglg1A越大，物质对光的吸收越强;反之,越弱。一、物理量透光率及吸光度35一、朗伯-比尔定律 1 1、 朗伯定律朗伯定律图2 光的吸收基本定律示意图 A=k1b A吸光度 k1比例常数362.2.比尔定律比尔定律 当单色光通过溶液层的厚度一定时，溶液的吸光度与溶液的浓度成正比，即比尔定律，表示为 ckIIlgA20图3 光的吸收基本定律示意图 37二、朗伯比尔定律

11、二、朗伯比尔定律3 3、朗伯比尔定律：、朗伯比尔定律：bcE lgA0IIE吸光系数 A吸光度,为无因次量 b液层厚度,一般单位为cm c 浓度,单位mol/l或g/100ml 即一束平行的单色光通过稀溶液时，溶液中吸光物质的吸光度与溶液的液层厚度和浓度之积成正比成正比。 38吸光系数的物理意义：吸光系数的物理意义： 讨论：讨论： 1）E=f（组分性质，温度，溶剂，） 当组分性质、温度和溶剂一定，E=f（） 2）不同物质在同一波长下E可能不同（选择性吸收） 3）E，物质对光吸收能力, 定量测定灵敏度 定性、定量依据bcAE单位浓度、单位厚度的吸光度39吸光系数两种表示法：吸光系数两种表示法：

12、1）摩尔吸光系数摩尔吸光系数： 在一定下，C=1mol/L，L=1cm时的吸光度%1110cmEM%11cmE40 在同一波长下，各组分吸光度具有在同一波长下，各组分吸光度具有加和性。加和性。 应用：多组分测定的理论依据应用：多组分测定的理论依据cbaAAAA总41lII厚度为透过光强为入射光强为00IIT 透光率TAlg吸光度42描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系浓度的关系lALamber定律：CABeer定律：动画1动画243 取物体中一极薄层xxdISdnkSdSdnkdSdnI透过薄层减弱的光强为几率光子通过薄层被吸收的不让光

13、子通过的面积为薄层的吸光质点数为设入射光强为SdnkIdIxxnIIxxSdSkIdI00SnEIISnkII00lglnClSnCVnlVS和由44 讨论：讨论：1 1Lamber-Beer定律的适用条件（前提）定律的适用条件（前提） 入射光为单色光入射光为单色光 溶液是稀溶液溶液是稀溶液2 2在同一波长下，各组分吸光度具有加和性在同一波长下，各组分吸光度具有加和性 应用：多组分测定应用：多组分测定lCEIIBeerLamber0lg定律表达式lCETAIITlg0吸光度透光率lECAT1010或：吸光系数EcbaAAAA总45 依据Beer定律，A与C关系应为 经过原点的直线 偏离Beer

14、定律的主要因素表现为 以下两个方面（一）化学因素（一）化学因素（二）光学因素（二）光学因素lCEA46 Beer定律适用的前提之一是：稀溶液定律适用的前提之一是：稀溶液 浓度改变会使浓度改变会使C与与A关系偏离定律关系偏离定律247 1非单色光的影响：非单色光的影响： Beer定律应用的重要前提定律应用的重要前提入射光为单色光入射光为单色光 照射物质的光经单色器分光后 并非真正单色光 其波长宽度由入射狭缝的宽度 和棱镜或光栅的分辨率决定 为了保证透过光对检测器的响 应，必须保证一定的狭缝宽度 这就使分离出来的光具一定的 谱带宽度4821020121IIII和为对应的透过光光强分别和入射光光强分

15、别为的光组成和设入射光由波长为lECIIlCEIITA10lglg0002010201020102010201211212110101010IIIIIIIIIIIITlCEElCElCElCE）（又0201020111210lglgIIIIlCETAlCEE）（49讨论：讨论： 入射光的谱带宽度严重影响吸光系数和吸收光谱形状 结论：结论： 选择较纯单色光（，单色性） 选max作为测定波长（E，S且成线性）偏离线性关系越严重与）（定律不成线性关系，偏离与成线性关系CAEEBeerCAEElCEAEE1221121502杂散光的影响：杂散光的影响： 杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度 范

16、围内，与所选波长相距较远杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成杂散光可使吸收光谱变形3散射光和反射光的影响：散射光和反射光的影响：反射光和散射光均是入射光谱带宽度内的光 直接对T产生影响散射和反射使T，A，吸收光谱变形注：一般可用空白对比校正消除4非平行光的影响：非平行光的影响：使光程，A，吸收光谱变形51影响测定结果的相对误差两个因素： T和T T影响因素：仪器噪音 1）暗噪音 2）讯号（散粒）噪音1lglgATATE C lCE lE l TTTCClg434. 0浓度的相对误差521）暗噪音）暗噪音与检测器和放大电路不确切性有关与检测器和放大电路不确切性有关 与光讯号无关与光讯号无关

17、0)lg()lg434. 0(434. 0)lg434. 0(2TTTTTTTdTd对应最小的测量误差，368. 04343. 0lgTT%5 . 0%1%2 . 0TT今假设大多数分光光度计的适宜测量范围7 . 02 . 0%20%65：AT测定结果相对误差较小0.20.753续前2）讯号噪音）讯号噪音与光讯号有关与光讯号有关l 表明测量误差较小的范围表明测量误差较小的范围一直可延至较高吸光度区，一直可延至较高吸光度区，对测定有利对测定有利 u光敏元件受光照射光敏元件受光照射时的电子迁移时的电子迁移 54 551光源：光源：2. 单色器：单色器：包括进包括进/出口狭缝、准直镜、色散元件、聚焦

18、透镜出口狭缝、准直镜、色散元件、聚焦透镜 棱镜棱镜对不同波长的光折射率不同对不同波长的光折射率不同色散元件色散元件 分出光波长不等距分出光波长不等距 光栅光栅衍射和干涉衍射和干涉 分出光波长等距分出光波长等距钨灯或卤钨灯钨灯或卤钨灯可见光源可见光源 3501000nm氢灯或氘灯氢灯或氘灯紫外光源紫外光源 200360nm一、主要部件一、主要部件563吸收池：吸收池： 玻璃玻璃能吸收能吸收UV光，仅适用于可见光区光，仅适用于可见光区 石英石英不吸收紫外光，适用于紫外和可见光区不吸收紫外光，适用于紫外和可见光区 要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）4检测器：将

19、光信号转变为电信号的装置检测器：将光信号转变为电信号的装置5记录装置：讯号处理和显示系统记录装置：讯号处理和显示系统光电池光电池光电管光电管光电倍增管光电倍增管二极管阵列检测器二极管阵列检测器571单光束分光光度计：单光束分光光度计：特点： 对光源要求高582双光束分光光度计双光束分光光度计： 特点： 不用拉动吸收池，可以减小移动误差 对光源要求不高 可以自动扫描吸收光谱 591. 1. 波长的校正波长的校正紫外区紫外区 测绘苯蒸气的吸收光谱测绘苯蒸气的吸收光谱可见光区可见光区 绘制镨钕玻璃的吸收光谱绘制镨钕玻璃的吸收光谱 2. 2. 吸光度的校正吸光度的校正硫酸铜、硫酸钴铵、硫酸铜、硫酸钴铵

20、、铬酸钾铬酸钾标准溶液标准溶液3. 3. 吸收池的校正吸收池的校正 要求：差值要求：差值1%1%60一、定性分析一、定性分析二、定量分析二、定量分析 61（一）定性鉴别（一）定性鉴别定性鉴别的依据吸收光谱的特征吸收光谱的形状吸收峰的数目吸收峰的位置（波长）吸收峰的强度相应的吸光系数621对比吸收光谱的特征值对比吸收光谱的特征值min%11maxmax，shcmE632对比吸光度或吸光系数的比值： 例：例：45. 315. 388. 170. 155036127836155036127812AAAAVB，三处最大吸收，定性鉴别：药典规定643对比吸收光谱的一致性对比吸收光谱的一致性同一测定条件下

21、，与标准对照物谱图或标准谱图进行对照比较65（二）纯度检查和杂质限量测定1纯度检查（杂质检查）662杂质限量的测定： 例：肾上腺素中微量杂质肾上腺酮含量计算 2mg/mL -0.05mol/L的HCL溶液， 310nm下测定 规定 A3100.05 即符合要求的杂质限量0.06%06. 01002101 . 1%/101 . 1100/101 . 1143505. 0334%11肾上腺酮mlmgmlglEACcm67（一）单组分的定量方法1吸光系数法 2标准曲线法 3对照法：外标一点法lECA定量依据：681吸光系数法（绝对法）吸光系数法（绝对法）要求单色光前提：iECAmLgCigW 求含样

22、过程：已知稀释)/(/)(lEAmLgCi100/lALmolCi/或%100%样CCii69例：维生素B12 的水溶液在361nm处的百分吸光系数为207，用1cm比色池测得某维生素B12溶液的吸光度是0.414，求该溶液的浓度。解：mLglEAC100/00200. 01207414. 070例：精密称取B12样品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm处测定吸光度为0.507，求B12的百分含量？解：mLgmLgCi/1045. 2100/1045. 21207507. 053mLgC/10

23、50. 2100101001050. 252样%0 .98%1001050. 21045. 2%100%5512样CCBi712标准曲线法标准曲线法条件前提：固定仪器和测定CACKA样样同上条件固定条件查得测定样品曲线分别测定配制标准系列过程：CAACA72 芦丁含量测定mLmgmLmLmLmg250 . 32550/200. 0样品标样分别移取73sCiCC3对照法：外标一点法对照法：外标一点法标样与样品浓度相近；截距为固定仪器和测定条件；前提：0标样和分别测定一定过程：AA标样标样标样标样AACCAACC74（二）多组分的定量方法（二）多组分的定量方法cbaAAAA总定量依据：三种情况：1

24、两组分吸收光谱不重叠两组分吸收光谱不重叠（互不干扰） 两组分在各自两组分在各自max下不重叠下不重叠分别按单组分定量分别按单组分定量aaaaaaEACCEA1111由bbbbbbEACCEA2222由bbaaAEAE222111；测定；测定过程：751测测A1b组分不干扰组分不干扰可按单组分定量测可按单组分定量测Ca2测测A2a组分干扰组分干扰不能按单组分定量测不能按单组分定量测Cb babaaaAEEAE2222111；和测定；测定过程：aaaaaaEACCEA1111由bbaababaCECEAAA22222由baababECEAC222763 3两组分吸收光谱完全重叠两组分吸收光谱完全重

25、叠混合样品测定混合样品测定（1）解线性方程组法）解线性方程组法（2）等吸收双波长消去法）等吸收双波长消去法（3）导数法）导数法77 步骤：步骤：babababaAEEAEE22221111；和测定；和测定bbaababaCECEAAA11111bbaababaCECEAAA22222bababbabbaaEEEEEAEAC12211221babaabaababEEEEEAEAC1221211278 步骤：步骤： 消除消除a的影响测的影响测bbabababaAAAAAA222111babbaabababaAAAAAAAAA)()(212121aaAAa2121和的等吸收点选bbbbbbbbaCE

26、CEEAAA)(2121bbabbbabEAEEAC21ab79消去消去b的影响测的影响测a 注：须满足两个基本条件注：须满足两个基本条件 选定的两个波长下干扰组分具有等吸收点选定的两个波长下干扰组分具有等吸收点 选定的两个波长下待测物的吸光度差值应足够大选定的两个波长下待测物的吸光度差值应足够大bbAAb 2 1 2 1和的等吸收点选aaaaaaabaCECEEAAA)(21 2 1abaaabaaEAEEAC 2 1ab80前提：干扰组分前提：干扰组分b不成峰形不成峰形 无等吸收点无等吸收点81步骤：b曲线上任找一点1 另一点2优点：同时将待测组分和干扰组分放大信号优点：同时将待测组分和干

27、扰组分放大信号K K倍，倍， 提高了待测组分测定灵敏度提高了待测组分测定灵敏度 倍率因子令KAAbb21)()()()(1212112212aabbababbababaAKAAKAAAAAKAKAAbA1bA2aaaaabaCEKEAKAA)(1212的干扰消除了bCAababaKAKAA22282解：9 .927%11cmEmLgmLgCi/10900. 4100/10900. 419 .927463. 064mLgC/10000. 55052001000.1063样%0 .98%10010000. 510900. 4%100%66样咖啡酸CCi5052001稀释因子注：83解：%11cmE

28、12000 .100120001010%11MEcmmLgmLglETlEACi/10165. 3100/10166. 311200417. 0lglg64mLgC/10000. 410022500500. 06样%15.79%10010000. 410165. 3%100%66样样品CCi84第五节第五节 有机化合物吸收光谱特征有机化合物吸收光谱特征 饱和碳氢化合物 含孤立助色团和生色团的有机化合物 共轭烯烃 ，不饱和酮、醛、酸和酯 芳香族化合物85饱和碳氢化合物 只有电子，只能产生跃迁 在200400nm没有吸收 作用：在UV光谱分析中常作溶剂86含孤立助色团的饱和有机化合物 A：分子中有

29、电子和n电子 B：除了产生跃迁，最典型 跃迁是n87 C：在近紫外区有吸收，在200nm左右（其原因：能量n小于跃迁） D：杂原子电负性小和离子半径大的，其n电子能级高，n跃迁所需的能量小，吸收峰波长较长)。88孤立生色团的化合物 醛、酮醛、酮 A：有双键、有杂原子 B：分子中除了产生跃迁，最典 型跃迁是n；n C：酮和醛有三个吸收峰：89 孤立双键的吸收峰在150180nm之间。 n跃迁吸收峰在190nm左右； n吸收峰在275295nm之间。90对象 饱和碳氢化合物上的氢被氧、氮、硫、 卤素等杂原子取代，即：饱和卤代烃、醇、醚、硫醇，胺。 醛、酮91共轭烯烃 未共轭多个双键： 在同一分子中

30、有两个双键，其间有两个以上次甲基隔开，则它们的吸收峰位置与只含一个双键的吸收峰位置相同，只是吸收强度约增加一倍。92 共轭多个双键： 分子中两个双键间只隔一个单键则成为共轭系统，生成大键，使与间能级距离变小，吸收峰长移，吸收增强。随着共轭体系增加，跃迁所需能量减小，吸收峰长移增加，增大，化合物可由无色逐渐变为有色。93，不饱和酮、醛、酸和酯 主要跃迁类型 和n跃迁 典型示例 A：若双键和羰基未形成共轭化合物，其紫外光谱分别呈现CC和CO双键的跃迁，约在200nm附近有两个强吸收峰，另外在约280nm处有羰基的n吸收峰。94 B：但在，不饱和醛、酮中，如果CO和CC基共轭， 使长移至200260nm，约为10 000。 而n跃迁长移到310350nm，100注：溶剂对不饱和酮、醛有显著影响，一般溶剂极性增加使带红移，而使n带蓝移。95酸和酯酸和酯 主要跃迁类型