GST－π类同工酶基因在卵巢癌组织中的表达及其与癌变的关系

1、    GST类同工酶基因在卵巢癌组织中的表达 及其与癌变的关系        摘要：目的：检测GST基因在卵巢癌组织中的表达，探讨GST与卵巢癌癌变的关系。方法：采用免疫组化和RTPCR方法，检测正常卵巢及卵巢良、恶性肿瘤组织中GSTmRNA及蛋白水平的变化。结果：GST在卵巢组织中的表达与肿瘤的进展密切相关，即正常组织中GST几乎不表达，良性肿瘤中水平略有升高，交界性肿瘤多为低、中度表达，但阳性率明显升高，接近卵巢癌组织的水平。癌变组织则为中、高度表达且随临床分

2、期的发展而逐渐增高。免疫组化与RTPCR的结果符合率较高，但以RTPCR法较为灵敏。结论：GST是与卵巢癌发生、发展密切相关的标志酶，它的表达异常与卵巢癌的预后有关。关键词：GST卵巢癌免疫组化RTPCRExpression of GST Gene in Ovarian Cancer Tissue and Its Relation to CarcinogenesisWang Hong Li Chunhai Chen Gaoming et alInstitute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Be

3、ijingAbstract Objective: GST gene expression was measured in ovarian cancer and its role in carcinogenesis was also discussed. Methods: Immunohistochemical staining and reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) were used to determine the expression level of GST in 139 ovarian biopsy se

4、ctions. Results: The expression level of GST was related to the development of ovarian tumor and an increasing tendency was observed in the normal tissue, benign tumor, borderline malignancy and malignant tumor. The positive rates obtained from immunohistochemical staining were 0 , 2.5 , 71 , 75.8 r

5、espectively, while the same from RTPCR were 0 , 5 , 71 , 85.5 respectively. Therefore, the results indicated that RTPCR was more simple, rapid, specific and sensitive than immunohistochemical method. Conclusion:Glutathione S Transferase might play a key role in the development of human ovarian cance

6、r and relates with the prognosis of cancer.Key Words GST Ovarian cancer Immunohistochemical staining RT PCR谷胱苷肽转移酶(glutathioneStransferases，GSTs)主要包括、等三类同工酶，参与机体的解毒功能。它们广泛分布于机体的各组织器官，但各亚类的分布具有器官特异性1。其中，类同工酶与人类肿瘤关系最密切。自从Sato等2从大鼠化学致癌实验中推测GSTPi是检测癌变“启动细胞”最早最灵敏的标志酶以来，与其相应的人GST与肿瘤的关系逐渐引起人们的重视，进而成为肿瘤学研究的

7、热点之一。本文以卵巢癌手术切除组织标本为研究对象，采用RTPCR和免疫组化方法，探讨GST基因在卵巢癌组织中的表达及其与卵巢癌发生发展的关系。1材料与方法1.1标本来源收集解放军总医院和解放军307医院的卵巢组织标本和石蜡切片139例，其中卵巢癌62例，交界性肿瘤7例，上皮来源良性肿瘤40例，正常卵巢30例，以上诊断均经病理科医生核实。1.2GST酶蛋白在卵巢癌组织中的表达1.2.1主要试剂和材料鼠抗人GST抗体由本室制备，ABC免疫组化试剂盒为美国Vector公司产品，购自北京中山生物工程公司。1.2.2方法采用标准ABC法3,4。1.2.3结果判定ABC法中阳性反应产物为棕黄色，分布于胞膜

8、和胞浆，依据阳性细胞数目和显色程度分为、±、。具体评分按Shimizu方法，在高倍镜下对细胞着色进行观察。着色范围：无着色为0，着色小于1/3为1，着色大于1/3为2，弥漫着色为3。将以上两项相加为最后结果，0为()，1为(±)，2为()，3为()，4为()。1.3GST基因在卵巢癌组织中的表达1.3.1组织总RNA的提取采用异硫氰酸胍酚氯仿一步法提取总RNA4，溶于适量DEPC处理的灭菌纯水中，RNA的定量与鉴定采用吸光度检测和甲醛变性琼脂糖凝胶电泳。1.3.2引物设计按照引物设计原则5设计引物并将引物设计在不同外显子上。GST引物取自cDNA序列5863882bp，31

9、1921213bp，扩增片段350bp6。actin基因引物取自cDNA序列5346367bp，3558580bp，扩增片段234bp7。1.3.3反转录合成cDNA第一链取卵巢组织总RNA1g，以oligo(dT)为引物，反应体系10l，65作用10min后加入反转录酶MMLV200U，37作用60min，95作用5min，产物于20保存。1.3.4PCR扩增10l反应体系含10×PCR缓冲液1l，反转录产物1l，30pmol/L的GST及actin引物各1l，TaqDNA聚合酶0.5U。阳性对照采用经测序鉴定的质粒，阴性对照以未经反转录的RNA代替cDNA模板，空白对照管未加Ta

10、qDNA聚合酶。反应在PE2400DNAThermalCycler上进行，条件如下：94变性30s，55退火1min，72延伸2min，共35个循环后72作用7min，反应产物保存于4。1.3.5PCR产物定量分析取扩增产物5l进行2琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，KodakDigitalScience凝胶成像系统照相，1D软件定量分析各条带的含量。GST片段/actin片段的比值为基因表达的相对量，比值小于0.1为低度表达()，比值介于0.1至0.4之间为中度表达()，比值大于0.4为高度表达()，目的基因无扩增条带为阴性。2结果2.1GST酶蛋白在卵巢肿瘤组织中的表达正常卵巢组织中不表达GS

11、T；良性肿瘤阳性率为2.5，阳性着色颗粒分布于胞浆和胞膜，Shimizu评分为34；交界性肿瘤阳性率明显高于良性者，为71；卵巢癌GST酶蛋白颗粒亦分布于胞浆与胞膜，且多为或以上，阳性率高达75.8，结合临床分期发现该酶蛋白的表达量与临床分期有关(P<0.01)，提示预后不良(见1、2，表1)。1GST在卵巢癌组织中的表达ABC 10×202卵巢癌组织内GST的表达主要分布于胞浆及胞膜ABC 10×40表1GST酶蛋白在卵巢组织中的表达分类GST例数阳性率（%）正常卵巢030300良性肿瘤139402.5交界性肿瘤52771卵巢癌47156275.8期571242期6

12、41060期2122391期15217892.2GST基因在卵巢肿瘤组织中的表达PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后表现为，GST为350bp条带，内参基因actin为234bp条带。RTPCR定量检测GST基因在卵巢组织中的表达结果见表2，经统计学分析，正常卵巢与良性肿瘤组织间该基因表达无明显差异，但在卵巢癌组表达显著升高(P<0.05)。表2GST基因在卵巢组织中的表达分类例数GST表达阳性率()低度中度高度正常卵巢300000良性肿瘤401105交界性肿瘤704171卵巢癌625173185.5合计1396223243.22.3免疫组化及RTPCR检测GST基因表达的比较139例标

13、本经免疫组化和RTPCR检测GST基因的表达，统计学分析表明，两种方法有较高的一致性，尤其对于癌组织中GST基因表达的检测RTPCR方法所得阳性率高于免疫组化值。RTPCR方法与免疫组织化学法相比，具有特异性较强、快速、简便等优点。3讨论肿瘤的发生是由于基因表达异常，引起蛋白质质和量的变化导致细胞生长、分化、死亡等生物学行为异常所致。GSTs作为一种重要的抗突变、抗肿瘤酶系在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。在卵巢肿瘤组织中GSTs的表达以GST为主，且从本文的实验结果来看，在良性病变发展到癌的过程中，GST的表达率逐渐增高，免疫组化的结果还发现GST的表达与临床分期有关(P<0.05

14、)，分期越高阳性表达越多，而临床分期越高预后越不好，因此提示GST的高表达与卵巢癌预后不良有关。从理论上讲，理想的肿瘤标志物应具有100的敏感性和100的特异性，可到目前为止还没有一个肿瘤标志物能满足上述标准，GST的敏感性在卵巢癌组织中达到70以上，达到了目前应用于临床肿瘤辅助诊断指标的一些肿瘤标志物的水平，但特异性较差，尚不能作为一个诊断性肿瘤标志酶。从方法上看，RTPCR技术与免疫组化相比要简单、快捷且特异性强，尤其是通过对PCR产物的定量分析，更能客观地评价其表达程度和生物学意义。GST酶蛋白在组织中的表达增高一般不外乎两种情况，一是蛋白合成量增加，二是由于蛋白质构象或结构变化导致半衰

15、期延长。任何有功能的蛋白质都遵循这样的法则。而从蛋白质合成途径上看，一个有功能蛋白的合成一般要经历由基因到基因转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰等过程。因此蛋白质的合成受多种因素多个水平的调节和控制，其中任何一个基本环节出现障碍，都将导致蛋白质的表达异常和功能变化。目前通过对人肿瘤细胞的研究初步认为，GSTs同工酶蛋白表达升高主要是由于基因mRNA转录水平增高所引起8,9，也可能存在转录后及翻译后修饰机制10,11。*本文课题受国家自然科学基金资助（编号39570733）作者单位：王宏李春海陈高明孙丽亚卞丽红军事医学科学院基础研究所肿瘤分子生物学实验室北京市100850杨毅毛慧生天津市肿瘤医院

16、分子生物学实验室参考文献1Layes JD,Pulford DJ. The glutathione transferase supergene family:regulation of GST and the isoenzymes to cancer chemoprotection and drug resistance.Crit Rev Biochem Mol Biol,1995;30(6):4452Sato K,Kitahara A,Sathoh K,et al. The placental form of glutathione s transferase as a new marker

17、 protein for preneoplasia in rat chemical hepatocarcinogenesis. Jpn J Cancer Res,1984;75(2):1993刘彦仿,主编.免疫组织化学.北京:人民卫生出版社,1990:154Chormczynski P,Sacchi N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate phenolchoroform extraction. Anal Biochem,1987;162:1565林万明,主编.PCR技术操作和应用指南.第一版.

18、北京:中国科学技术出版社,1991:69926Cowell IG, Dixon KH, Pembke S,et al. The structure of the human glutathion S transferase pi gene. Biochem J,1988;255(1):79817Sadayo NI, Hiroshi H, Premkumar R,et al. Molecular structure of the human cytoplasmic actin gene:interspecies homology of sequence in the introns. Proc Natl Acad Sci USA,1985;83:6133448齐春会,李春海.胎盘型谷胱甘肽S转移酶基因在胃癌中的表达.生物化学与生物物理进展,1994;21(5):46369周江,齐春会,李春海,等.GSTs同工酶基因在乳腺癌中的扩增与基因表达.生物化学杂志,1995;11(5):551610Kuznich S,Vandervee