Chapter10Transcriptioninprokaryotes

1、转录转录 (transcription) 生物体以生物体以DNA为模板合成为模板合成RNA的过程的过程 转转录录RNADNA 5 5 3 3 3 3 5 5 模板链模板链编码链编码链编码链编码链模板链模板链结构基因结构基因转录方向转录方向转录方向转录方向不对称转录不对称转录(asymmetric transcription) 在在DNA分子双链上某一区段，一股链用分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录作模板指引转录，另一股链不转录 ； 模板链并非永远在同一条单链上。模板链并非永远在同一条单链上。参与转录的物质参与转录的物质原料原料: : NTP (ATP, UTP, GTP

2、, CTP) 模板模板: : 解开成单链的解开成单链的DNA酶酶: : RNA聚合酶聚合酶(RNA polymerase, RNA pol)其他蛋白质因子其他蛋白质因子单链单链DNA病毒病毒：正链，有意义链，编码链；：正链，有意义链，编码链； 负链，反义链，转录模板。负链，反义链，转录模板。正链正链RNA病毒病毒：作为：作为mRNA或序列与或序列与mRNA一致一致负链负链RNA病毒病毒：以其：以其RNA的互补链为的互补链为mRNA编码链编码链sense strand ：链、有意义链、非模板链，碱基序列与链、有意义链、非模板链，碱基序列与 mRNA一致一致（DNA：T，RNA：U），），无转录功

3、能无转录功能模板链模板链antisense strand ：链、反义链，合成链、反义链，合成RNA的转录模板的转录模板 ：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。是序列。是 原核启动子区大约原核启动子区大约70-80bp长，有特殊的结构。长，有特殊的结构。 转录因子：转录因子：RNA聚合酶起始转录需要的辅助因子。聚合酶起始转录需要的辅助因子。 -35-105-9bpTATAAT16-19bpTTGACA转录起点转录起点大肠杆菌启动子的保守序列大肠杆菌启动子的保守序列 - 35序列其保守序列为序列其保守序列为TTGACA（T82T84G78A65C54A

4、45），）， 与与-10序列相隔序列相隔1619bp。功能：功能：l 为为RNA 聚合酶的识别位点。聚合酶的识别位点。RNA 聚合酶的核心酶只能起聚合酶的核心酶只能起到和模板结合和催化的功能，并不能识别到和模板结合和催化的功能，并不能识别-35序列，只有序列，只有亚基才能识别亚基才能识别-35序列，为转录选择模板链。序列，为转录选择模板链。l -35序列和序列和-10序列的距离是相当稳定的，过大或过小都会序列的距离是相当稳定的，过大或过小都会降低转录活性。这可能是因为降低转录活性。这可能是因为RNA 聚合酶本身的大小和聚合酶本身的大小和空间结构有关。空间结构有关。原核生物的原核生物的RNA聚合

5、酶聚合酶核心酶(core enzyme) :2as a specificity factor细菌细菌RNA聚合酶的组成：聚合酶的组成： E. Coli RNA聚合酶全酶由聚合酶全酶由5个亚基个亚基组成：组成：2 ，分子量为，分子量为480kd。2 构成核心酶，与构成核心酶，与亚基构成全酶。亚基构成全酶。 核心酶不能区分启动子和一般序列，核心酶不能区分启动子和一般序列，与与DNA结合常数约为结合常数约为109，停留半衰期，停留半衰期约为约为60min，当，当因子与核心酶构成全因子与核心酶构成全酶后，与酶后，与DNA一般序列结合常数为一般序列结合常数为105，半衰期小于半衰期小于1S，而与启动子区

6、结合常，而与启动子区结合常数为数为1012，半衰期为数小时，所以，半衰期为数小时，所以亚亚基又称起始亚基。基又称起始亚基。 核心酶核心酶 (core enzyme)全酶全酶 (holoenzyme)细菌细菌RNA聚合酶的功能聚合酶的功能:l识别和结合DNA链上的启动子；l能沿着DNA双链作单向运动；l解开DNA双螺旋，转录后又恢复双螺旋；l同时与局部分离的DNA链以及转录产物RNA链结合；l按模板原则选择正确底物，按5-3方向合成RNA链；l识别转录的终止信号；l能与转录因子互相作用，调节转录速度；l能在转录受到阻遏的情况下进行自身调整，借助辅助因 子，恢复和维持RNA合成E. Coli的的R

7、NA聚合酶各亚基的性质和功能聚合酶各亚基的性质和功能2 、因子因子功能：功能： 它识别启动子并将封闭的启动子复合物转换成它识别启动子并将封闭的启动子复合物转换成开放的状态。开放的状态。一旦转录起始，一旦转录起始，因子从全酶中脱离。核心因子从全酶中脱离。核心酶能与酶能与DNA结合，但效率低，特异性差。结合，但效率低，特异性差。 增加增加RNA聚合酶对启动子的特异性结合，减少聚合酶对启动子的特异性结合，减少非特异性结合。非特异性结合。不同启动子需要不同不同启动子需要不同因子因子 大肠杆菌大肠杆菌RNA聚合酶与聚合酶与DNA的相互作用的相互作用E.coli的不同的不同因子识别不同的共同顺序因子识别不

8、同的共同顺序1 转录的起始转录的起始 转录起始需解决两个问题：转录起始需解决两个问题： RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。 DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。 起始的过程可分为四个阶段起始的过程可分为四个阶段 1）亚基辨认起始点，RNA聚合酶全酶(2)与模板结合， 形成闭合转录复合体； 2）DNA双链解开形成开放转录复合体； 3）在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始 复合物RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3。 RNA链的延伸阶段开始后，因子即从核心酶-DNA-新生RNA复合体上解离下来，并可再用于和新的核心酶结合. 因子被释

9、放的原因：它已不起作用；因子如仍然存在将会造成RNA聚合酶与启动子序列结合过紧，以致不能再沿着模板移动。 当因子被释放后，新生链-酶复合体与DNA模板的结合很弱，并且酶亦不再要求与特异序列的DNA结合时，链的延伸才能达到最佳状态。2 2 转录的延伸转录的延伸 延伸的时候，酶后端边缘的分界线也可作为RNA链延伸的末端处。即酶的后端向前每移动1bp，RNA延伸的末端也就加上了一个rNTP，但酶的前端并没有移动，仍保持原来的位置，只不过酶整体收缩了1bp的长度。酶内部所覆盖的DNA双链的开放区及RNA的生长点（3端）都向前移动了1个bp。 当RNA链已延伸到多个nt时，酶的前端突然向前一下子延伸7-

10、8bp。延伸时RNA 聚合酶以稳定收缩和突然伸展的方式在DNA上“爬行”，稳定的收缩是指RNA聚合酶从35bp长连续地收缩到28bp，然后前端又突然向前伸展8bp,RNA聚合酶又恢复到35bp长。 1. 亚基脱落，亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；模板前移； 2. 在在核心酶核心酶作用下，作用下，NTP不断聚合，不断聚合，RNA链链不断延长。不断延长。(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi转录的延伸阶段：转录的延伸阶段：转录空泡转录空泡(transcription bubble)：转录过程中，转

11、录过程中，RNA聚合酶及其所覆盖的聚合酶及其所覆盖的DNA双链以及合成的双链以及合成的RNA共同共同构成的复合物构成的复合物,又称为又称为转录复合物转录复合物。RNA-pol （核心酶）（核心酶） DNA RNA3 3 原核生物转录的终止原核生物转录的终止 原核生物转录的终止处有特殊结构的存在，称为终止子，RNA Pol能识别t位点在此处停止，然后释放RNA，最终RNA聚合酶也脱离模板，终止了转录。 在原核细胞中有两种不同的终止子，一种是强终止子，另一种是弱终止子。强终止子在体外实验中，无需其他任何因子的帮助就可以终止核心酶，这种终止子被称为内部终止子。弱终止子需要在一种蛋白质因子（rho f

12、actor）的帮助一才能终止，所以又称为依赖性终止子。 强终止子的结构有三个特点强终止子的结构有三个特点 有回文结构存在。由它转有回文结构存在。由它转录出录出mRNAmRNA可形成茎环结构，可可形成茎环结构，可阻止阻止RNA RNA 聚合酶的前进；聚合酶的前进； 茎的区域富内含茎的区域富内含G-CG-C，使，使茎环不易解开；茎环不易解开； 强终止子强终止子33端上有端上有6 6个个U U，由于它和模板形成的连续由于它和模板形成的连续U-AU-A配对较易打开，从而便于释放配对较易打开，从而便于释放出出RNARNA。图图 强终止子的结构强终止子的结构为什么这两个结构能引起终止呢为什么这两个结构能引

13、起终止呢? 发夹的茎的前半部过早地和发夹的茎的前半部过早地和RNA-DNA杂交杂交双链中的后半部分退火，仅剩下多聚双链中的后半部分退火，仅剩下多聚U序列和模序列和模板链杂交。因为这样一个由几个板链杂交。因为这样一个由几个U和几个和几个dA形成形成的的RNA-DNA杂交双链是很不稳定的，于是新生杂交双链是很不稳定的，于是新生RNA链将很快自链将很快自DNA双链中被排除出来。双链中被排除出来。茎环结构使转录终止的机理茎环结构使转录终止的机理 使使RNA聚合酶变构，转录停顿；聚合酶变构，转录停顿； 使转录复合物趋于解离，使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。产物释放。5 pppG5 3 3 5 RN

14、A-pol图图 弱终止子的结构弱终止子的结构RNA聚合酶转录聚合酶转录mRNA因子附着到因子附着到mRNA识别位点识别位点 因 子 在因 子 在 R N A 聚 合 酶 后 面 沿聚 合 酶 后 面 沿mRNA移动移动RNA聚合酶在终止位点停留，聚合酶在终止位点停留，因子赶上了聚合酶因子赶上了聚合酶在转录泡中在转录泡中因子解开因子解开DNA-RNA杂合链杂合链终止终止RNA聚合酶，聚合酶，因子和因子和RNA被释被释放放 图图1 在原核在原核mRNA转录中转录中依赖性终止机制。依赖性终止机制。图图 转录的过程转录的过程电镜下的转录现象电镜下的转录现象5 3 DNA原核生物转录过程中的羽毛状现象原

15、核生物转录过程中的羽毛状现象核糖体核糖体RNARNA聚合酶聚合酶 F雅各布（Francois Jacob 19202013）法国生物化学家、分子生物学家 JL莫诺（Jacques L. Monod 19101976）法国生物学家 大肠杆菌可以利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等作为碳源而生长繁殖，当培养基中含有葡萄糖和乳糖时，细菌优先使用葡萄糖，当葡萄糖耗尽，细菌停止生长，经过短时间所以适应，就能利用乳糖，细菌继续呈指数式繁殖增长。 操纵子：操纵子：在代谢途径中功能密切相关的一组蛋白质编码的在代谢途径中功能密切相关的一组蛋白质编码的结构基因区域加上其调控区域组成的控制单元。结构基因区域加上其调

16、控区域组成的控制单元。结构基因结构基因调节基因调节基因操纵基因操纵基因控制区信息区乳糖操纵元典型的操纵子可分为控制区和信息区两部分。控制区由各种调控基因所组成，而信息区则由若干结构基因串联在一起构成。结构基因结构基因（structural gene, SG）：编码蛋白质蛋白质多肽链和功能RNA的基因。在细菌基因组中，编码功能相关的结构基因通常成簇排列在一起，共转录到一条mRNA分子上，由同一个控制元件和启动子驱动。调节基因调节基因（regulatory gene）：编码能与操纵序列结合的调控蛋白的基因。调节蛋白与DNA上特定位点结合控制转录阻遏蛋白阻遏蛋白(repressor)(repress

17、or)的结合位点的结合位点当操纵序列结合有当操纵序列结合有阻遏蛋白阻遏蛋白时，会阻碍时，会阻碍RNARNA聚合酶与启动序列的结合，或是聚合酶与启动序列的结合，或是RNARNA聚合酶聚合酶不能沿不能沿DNADNA向前移动向前移动 ，阻碍转录。，阻碍转录。启动序列启动序列编码序列编码序列操纵序列操纵序列polpol阻遏蛋白阻遏蛋白 操纵序列操纵序列 其他调节序列、调节蛋白其他调节序列、调节蛋白如：激活蛋白如：激活蛋白(activator)(activator)可结合启动序可结合启动序列邻近的列邻近的DNADNA序列，促进序列，促进RNARNA聚合酶与启动序聚合酶与启动序列的结合，增强列的结合，增强

18、RNARNA聚合酶活性。聚合酶活性。启动序列启动序列编码序列编码序列操纵序列操纵序列polpol激活蛋白激活蛋白有些基因在没有激活蛋白存在时，有些基因在没有激活蛋白存在时，RNARNA聚聚合酶很少或完全不能结合启动序列。合酶很少或完全不能结合启动序列。启动序列启动序列编码序列编码序列操纵序列操纵序列polpol激活蛋白激活蛋白图图 转录水平的负调控与正调控转录水平的负调控与正调控 mRNA阻遏蛋白阻遏蛋白IDNAZYAOPpol没有乳糖存在时没有乳糖存在时阻遏基因阻遏基因乳糖操纵子的负调节机制乳糖操纵子的负调节机制mRNA阻遏蛋白阻遏蛋白有乳糖存在时有乳糖存在时IDNAZYAOPpol启动转录

19、启动转录mRNA乳糖乳糖半乳糖半乳糖-半乳糖苷酶半乳糖苷酶阻遏物阻遏物有有2个结合位点：一个是诱导物结合位点，另一个结合位点：一个是诱导物结合位点，另一个是操纵基因结合位点。当诱导物在相应位点结合时，个是操纵基因结合位点。当诱导物在相应位点结合时，它改变了阻遏蛋白的构象，干扰了另一位点的活性。这它改变了阻遏蛋白的构象，干扰了另一位点的活性。这种类型的调控叫种类型的调控叫变构调控变构调控。 lac操操纵纵子子可可诱诱导导的的负负调调控控乳糖操纵子的正调节机制乳糖操纵子的正调节机制 细菌优先利用葡萄糖作为碳源，抑制其细菌优先利用葡萄糖作为碳源，抑制其他糖类代谢的操纵子表达，如果有葡萄糖存他糖类代谢

20、的操纵子表达，如果有葡萄糖存在，即使有乳糖等其它诱导物碳源的存在，在，即使有乳糖等其它诱导物碳源的存在，也优先利于葡萄糖。也优先利于葡萄糖。CAP的正性调节的正性调节:catabolic activator protein (CAP蛋白蛋白)是一个同二聚体，是一个同二聚体，具有具有DNA结合域和结合域和cAMP结合位点。当没有葡萄糖存在时，结合位点。当没有葡萄糖存在时，由于由于cAMP的浓度受葡萄糖代谢的调节，的浓度受葡萄糖代谢的调节，cAMP浓度表现浓度表现为较高，这时为较高，这时cAMP与与CAP蛋白结合形成蛋白结合形成cAMP- CAP复复合物。此复合物可结合剂合物。此复合物可结合剂lac启动基因上游附近的启动基因上游附近的CAP位位点上，从而可增强转录达点上，从而可增强转录达50倍之多。倍之多。葡萄糖分解代谢降低葡萄糖分解代谢降低cAMP水平，使得其他分解代谢受阻。水平，使得其他分解代谢受阻。AYZOPI无葡萄糖，cAMP浓度高时CAPcAMPRNA pol有葡萄糖，cAMP浓度低时AYZOPIRNA polCAP乳糖操纵子调控方式的比较乳糖操纵子调控方式的比较与变构物结合与变构物结合 无活性无活性 有活性有活性负调控负调控正调控正调控调节蛋白调节蛋白 阻遏蛋白阻遏蛋