荧光定量PCR技术培训-康为

1、实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术技术原理、应用及实践原理、应用及实践(Real time Quantitative PCR)北京康为世纪生物科技有限公司北京康为世纪生物科技有限公司Real time Quantitative PCR2 2北京康为世纪生物科技有限公司北京康为世纪生物科技有限公司v我们的目标：中国的我们的目标：中国的Invitrogen v完善的产品线完善的产品线v一站式的服务平台一站式的服务平台3北京康为世纪生物科技有限公司北京康为世纪生物科技有限公司v核酸提取核酸提取vPCR、RT-PCR 及荧光定量及荧光定量PCRvDNA 分子量标准分子量标准v克隆与转化克隆与转化

2、v蛋白提取与纯化蛋白提取与纯化v蛋白定量、蛋白蛋白定量、蛋白Marker及蛋白电泳产品及蛋白电泳产品vWestern Blot产品产品v免疫组化产品、免疫沉淀免疫组化产品、免疫沉淀v标签抗体标签抗体v内参抗体内参抗体v二抗二抗完善的产品线完善的产品线4五大平台五大平台 一站式服务一站式服务5园区公共服园区公共服务平台务平台2010年康为世纪公司依托江苏年康为世纪公司依托江苏省泰州市政府及中国医药城的省泰州市政府及中国医药城的支持政策，成立江苏康为世纪，支持政策，成立江苏康为世纪，主要进行创新的临床诊断试剂主要进行创新的临床诊断试剂的研发、生产与相应的技术服的研发、生产与相应的技术服务，务，占地

3、面积约占地面积约3300平米平米2700平米的实验区平米的实验区: 临床生化诊断试剂研发平台临床生化诊断试剂研发平台免疫诊断试剂研发平台免疫诊断试剂研发平台分子诊断试剂研发平台分子诊断试剂研发平台免疫组化诊断试剂研发平台免疫组化诊断试剂研发平台约约300平米平米GMP标准的生产车间标准的生产车间总投资总投资6500万元万元泰州国家生物产业基地临床诊断试剂研发泰州国家生物产业基地临床诊断试剂研发与生产公共服务平台与生产公共服务平台 6荧光定量荧光定量PCR仪仪芯片点样仪芯片点样仪芯片扫描仪芯片扫描仪全自动核酸全自动核酸提取仪提取仪超速离心机超速离心机 焦磷酸焦磷酸DNA测序仪测序仪分子生物学平台

4、分子生物学平台凝胶成像仪凝胶成像仪泰州国家生物产业基地临床诊断试剂研发泰州国家生物产业基地临床诊断试剂研发与生产公共服务平台与生产公共服务平台 芯片杂交仪芯片杂交仪康为世纪生物科技有限公司康为世纪生物科技有限公司7完善的产品线完善的产品线v分子生物学分子生物学 全系列产品全系列产品v蛋白质学产品蛋白质学产品v免疫学相关产品免疫学相关产品一站式服务平台一站式服务平台v实验设计平台实验设计平台v分子生物学平台分子生物学平台v蛋白表达与纯化蛋白表达与纯化 平台平台v抗体制备纯化平台抗体制备纯化平台v免疫学检测平台免疫学检测平台北京康为世纪生物科技有限公司北京康为世纪生物科技有限公司我们的客户我们的客

5、户我们的合作伙伴我们的合作伙伴v北京大学、清华大学、北京大学、清华大学、 复旦大学等复旦大学等v中国科学院协和医院、中国科学院协和医院、 上海瑞金、军事医学上海瑞金、军事医学 科学院科学院v301医院、医院医院、医院v华大基因、诺华制药华大基因、诺华制药v九强、博奥等九强、博奥等v a-Bisabolol induces dose-and time-dependent apoptosis in HepG2 cells via a Fas-and mitochondrial-related pathway,involves p53 and NFkB vState Key Laboratory o

6、f Virology, College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, China v CCR4-NOT Deadenylates mRNA Associated with RNA-Induced Silencing Complexes in Human Cells State Key Laboratory of Molecular Biology and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences

7、, Shanghai, Chinav Coadministration of huperzine A and ligustrazine phosphate effectively reverses scopolamine-induce damnesia in rats School of Pharmacy, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, PRChinav Effects of Microgravity Modeled by Large Gradient High Magnetic Field

8、on the Osteogenic Initiation of Human Mesenchymal Stem Cellsv CCR4-NOT deadenylates RISC-associated mRNA in human cells State Key Laboratory of Molecular Biology, Institute of Biochemistry and Cell Biology Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Science shanghai,china 主要内容主要内

9、容 Company nameReal-time qPCR的定量原理的定量原理2Real-time qPCR的检测方法的检测方法3Real-time qPCR的基本概念的基本概念 1Real-time qPCR的解析方法的解析方法 4PCRPCR：基本原理：基本原理Denaturation: 94 96CAnnealing: 50 65CExtension: 70 75C基本要素：基本要素： Template Primers DNA polymerase dNTP, N=A,G,C or T PCRPCR：基本原理：基本原理Company name理想的理想的PCR反应：反应： N=N0*2n实

10、际的实际的PCR反应：反应： N=N0* (1+E)nN0：初始模板量：初始模板量N：第：第n次循环后的产物量次循环后的产物量 n：扩增反应的循环次数：扩增反应的循环次数 E：扩增效率：扩增效率S形曲线，具有平台效应形曲线，具有平台效应Company name 与普通与普通PCRPCR的对比的对比同一个样本进行同一个样本进行9696次重复次重复传统传统PCR检测检测Real time PCR Real time PCR 检测检测v Real time PCR-Real time PCR-起点检测起点检测： - - 起点量是样本中起始的起点量是样本中起始的DNADNA量量- - “加入了加入了5

11、00500个拷贝个拷贝”- - 具有重现性，误差小具有重现性，误差小v 传统传统PCR-PCR-终点检测终点检测： - - 终点产物量经过终点产物量经过PCRPCR放大的放大的DNADNA量量- - “生成了生成了500500，00000000，00000000个拷贝个拷贝”- - 不恒定，误差大不恒定，误差大传统传统PCR检测检测Real-time qPCR激发光激发光发射光发射光- - 在在PCRPCR反应体系中加入荧光基团。反应体系中加入荧光基团。- - 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。- - 利用荧光信号的变化动态监测整个

12、反应过程。利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。 荧光基团荧光基团 扩增曲线扩增曲线（primary curve）Company name扩增曲线：扩增曲线：随着随着PCRPCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）线性图线性图对数图对数图Company name 荧光阈值（荧

13、光阈值（threshold）基线基线(baseline)(baseline)：一般以一般以PCRPCR反应前反应前1515个循环的荧光信号作为本底信号个循环的荧光信号作为本底信号荧光阀值荧光阀值(threshold)(threshold)：扩增曲线上人为设定的一个值扩增曲线上人为设定的一个值- - 缺省设置：缺省设置：PCRPCR反应前反应前3-153-15个循环荧光本底信号标准偏差的个循环荧光本底信号标准偏差的1010倍倍- - 手动设置：大于样本的荧光背景值手动设置：大于样本的荧光背景值 Ct 值值(Cycle Threshold)Company nameCtCt值值：PCRPCR扩增过程

14、中，扩增产物的荧光信号达到扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，荧光值所对应的设定的阈值时，荧光值所对应的PCRPCR循环次数。循环次数。 起始模板量起始模板量 基线基线 阈值阈值 CtCt值值 Ct 值值(Cycle Threshold)Company nameCtCt值的特点值的特点：相同模板进行相同模板进行9696次扩增，平台期次扩增，平台期DNADNA拷贝数波动拷贝数波动很大，但很大，但CtCt值相对固定；值相对固定；CtCt值则极具重现性值则极具重现性CtCt值可以确定初始模板量？值可以确定初始模板量？R Rn n=R=RB B+ X+ X0 0 (1+E)(1+E)N N

15、 * * R RS S第第n n个循环的总信号个循环的总信号 = =本底信号本底信号 + + 起始起始DNADNA数目数目 * * PCRPCR扩增效率扩增效率 * * 单位信号强度单位信号强度当循环次数当循环次数n=Ctn=Ct时时R RCtCt=R=RB B+ X+ X0 0 (1+E)(1+E)Ct Ct * * R RS S两边同时取对数得两边同时取对数得: :lg(Rlg(RCtCt-R-RB B)=lgX)=lgX0 0+Ctlg(1+E)+lgR+Ctlg(1+E)+lgRS SCt=-lgXCt=-lgX0 0/lg(1+E)+ lg(R/lg(1+E)+ lg(RCtCt-R

16、-RB B)-lgR)-lgRS S/lg(1+E)/lg(1+E) Ct=-klgXCt=-klgX0 0+b+bCompany namelgXlgX0 0与与CtCt值呈线性关系值呈线性关系根据根据CtCt值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数起始拷贝数越多，起始拷贝数越多，CtCt值越小。值越小。Company nameRn vs. Cycle number- Rn vs. Cycle number- 扩增曲线扩增曲线LogDNA vs. Ct - LogDNA vs. Ct - 标准曲线标准曲线.未知未知10410310610510210标准曲

17、线标准曲线 (standard curve)标准曲线分析标准曲线分析- - 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释y = -ax+b y = -ax+b 测定荧光定量测定荧光定量PCRPCR反应的有效性反应的有效性- - 线性的标准曲线：相关系数线性的标准曲线：相关系数R R2 2- - 扩增效率：扩增效率： 扩增效率扩增效率(E)=10(E)=10-1/-1/斜率斜率-1 -1 标准曲线标准曲线分析分析 荧光定量荧光定量PCRPCR检测方法检测方法Company name染料标记：染料标记： SYBR Green Super green探针标记：探针标记：水

18、解探针：水解探针： TaqMan非水解探针：非水解探针：Molecular beacon Company nameSYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理l SYBR Green ISYBR Green I 是是一种与双链一种与双链DNADNA小小沟结合的荧光染料。沟结合的荧光染料。l SYBR Green ISYBR Green I只只与双链与双链DNADNA结合才结合才能发出荧光。能发出荧光。l 荧光信号与双链荧光信号与双链DNADNA分子数成正分子数成正比，随着扩增产物增加而增加。比，随着扩增产物增加而增加。 荧光信号强度与反应体系中荧光信号强度与反应体系中所

19、有双链所有双链DNADNA分子成正比。分子成正比。5353SGSGSGSG5353SGSGSGSGEmissionExcitation- - 变性时，变性时，DNADNA双链分开，无荧光信号。双链分开，无荧光信号。- - 延伸结束时，采集荧光信号。延伸结束时，采集荧光信号。 SYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理 SYBR Green I SYBR Green I优点：优点：v 使用方便，成本低使用方便，成本低- - 仅需设计两个引物仅需设计两个引物v 通用性好通用性好- - 对对DNADNA模板没有选择性模板没有选择性需要在反应结束时，对产物做融解曲线分析。需要

20、在反应结束时，对产物做融解曲线分析。缺点：缺点：v SYBR GreenSYBR Green与所有双链与所有双链DNADNA结合结合- - 引物二聚体或错误扩增产引物二聚体或错误扩增产物造成假阳性物造成假阳性- - 只能检测单一模板，无法只能检测单一模板，无法进行多重检测进行多重检测Company name 将温度对荧光强度的变化求导。将温度对荧光强度的变化求导。(-dI/dT)(-dI/dT) 融解曲线融解曲线 (dissociation curve) 确认确认PCRPCR反应产物的特异性反应产物的特异性 对数图谱对数图谱 原始图谱原始图谱融解曲线分析融解曲线分析- - 非特异性产物非特异性

21、产物- - 引物二聚体引物二聚体 Taqman 工作原理工作原理v 探针与靶序列配对探针与靶序列配对 （一段序列，两个基团，（一段序列，两个基团，5 5 报告基团、报告基团、3 3淬灭基团）淬灭基团）v 完整的探针，报告基团完整的探针，报告基团R R发射的荧光被淬灭基团发射的荧光被淬灭基团QQ淬灭，淬灭， 没有荧光产生。没有荧光产生。v 聚合酶的聚合酶的5 5外切酶活性外切酶活性v 报告基团报告基团R R与淬灭基团与淬灭基团QQ分离，发射荧光。分离，发射荧光。RQReporterQuencherRQ荧光信号强度与结合探针的荧光信号强度与结合探针的DNADNA分子成正比。分子成正比。 Taqma

22、n 工作原理工作原理 在退火过程中，探针与靶序列结合在退火过程中，探针与靶序列结合探针被探针被Taq酶的酶的5- 3 外切酶活性剪切成片断外切酶活性剪切成片断游离报告基团发出荧光游离报告基团发出荧光在延伸过程中，探针部分与靶序列分离在延伸过程中，探针部分与靶序列分离 SYBR Green I与与Taqman 对比对比Taqmanv特异性高特异性高- 与特异靶序列结合与特异靶序列结合v对模板有选择性对模板有选择性- 可进行多重可进行多重PCR反应反应 SYBR Green Iv 使用方便，成本低使用方便，成本低- - 仅需设计两个引物仅需设计两个引物v通用性好通用性好- - 对对DNADNA模板

23、没有选择性模板没有选择性 荧光定量荧光定量PCRPCR解析方法解析方法v绝对定量绝对定量 样本中核酸的量（拷贝数、微克）样本中核酸的量（拷贝数、微克）- - 检测某给定血液样本中的病毒颗粒数，有检测某给定血液样本中的病毒颗粒数，有60006000个拷贝个拷贝v相对定量相对定量 不同样本中目的基因表达量的差异不同样本中目的基因表达量的差异- - 肿瘤组织和正常组织相比肿瘤组织和正常组织相比 某个基因的表达量某个基因的表达量mRNAmRNA改变了多少倍，改变了改变了多少倍，改变了6060倍倍绝对定量绝对定量Sample- - 样本起始浓度与样本起始浓度与CtCt呈线性关系，根据已知拷贝的标呈线性关

24、系，根据已知拷贝的标准品作出标准曲线。准品作出标准曲线。- -根据未知样品的根据未知样品的CtCt值，推算出未知样本量。值，推算出未知样本量。以标准品为标杆以标准品为标杆绝对定量的步骤绝对定量的步骤拷贝数计算拷贝数计算对标准品进行梯度浓度稀释对标准品进行梯度浓度稀释荧光定量荧光定量PCR反应反应建立标准品建立标准品未知样品未知样品Ct代入标准曲线代入标准曲线确定拷贝数确定拷贝数质粒提取质粒提取OD值测定值测定计算样本浓度计算样本浓度/样本分子量样本分子量/样本拷贝数样本拷贝数标准品进行标准品进行5-6个个梯度稀释梯度稀释标准品稀释倍数为标准品稀释倍数为10绝对定量举例绝对定量举例CtCt值值

25、拷贝数拷贝数CtCt值值拷贝数拷贝数相对定量相对定量 参照样本参照样本 Calibrator用于比较结果的基准。用于比较结果的基准。35 相对定量相对定量 特点特点选择内参基因选择内参基因内参基因内参基因beta-actinbeta-actin、GAPDHGAPDH、 18S rRNA18S rRNA等等看家基因看家基因housekeepinggene在细胞中的表达量在细胞中的表达量或在基因组中的拷或在基因组中的拷贝数恒定，受环境贝数恒定，受环境因素影响较小因素影响较小- 文献检索文献检索- 实验筛选实验筛选内参基因内参基因- - 同样体积或重量的样本所来源的细胞数目不同。同样体积或重量的样本

26、所来源的细胞数目不同。- RNA- RNA抽提、反转效率不同，操作中存在误差。抽提、反转效率不同，操作中存在误差。对样本初始浓度差异进行均一化校正。对样本初始浓度差异进行均一化校正。2- Ct法法Company name成立条件：成立条件：假设扩增效率为假设扩增效率为100%满足条件：满足条件：1）内参基因和目标基因的扩增效率接近）内参基因和目标基因的扩增效率接近 2）内参基因和目标基因的扩增效率均为）内参基因和目标基因的扩增效率均为90%-110%假设条件：假设条件： 内参基因和目标基因扩增效率差异大于内参基因和目标基因扩增效率差异大于5% 1）优化实验条件，使扩增效率接近）优化实验条件，使

27、扩增效率接近 2）使用其他方法）使用其他方法 相对定量方法相对定量方法 2- Ct法法 相对定量举例相对定量举例相对定量分析相对定量分析 待测样品目的基因 浓度 待测样品内参基因 浓度 F= 对照样品目的基因 浓度 对照样品内参基因 浓度假设条件：假设条件： 内参基因和目标基因扩增效率不同内参基因和目标基因扩增效率不同 优点：优点：实验优化简单实验优化简单 缺点：缺点：每一轮实验都必需做标准曲线每一轮实验都必需做标准曲线 双标准曲线法双标准曲线法80% 相对定量举例相对定量举例 双标准曲线法双标准曲线法 实实 验验 流流 程程Company name SYBR Green法实验流程法实验流程

28、Company name样本处理样本处理RNARNA提取提取qPCR数据分析数据分析逆转录逆转录 样本处理与样本处理与RNA提取提取v 外界刺激 10min 可检测的表达改变v 样品离开定义环境 2min 裂解、固定细胞TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS）液氮RNA保存液 v 小心DNA污染！使用DNase 阴性对照 逆转录逆转录逆转录引物选择逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？ RT-PCR一步法还是两步法？一步法还是两步法？两步法两步法: : 反转录和反转

29、录和PCRPCR扩增分两步进行。扩增分两步进行。 步骤多但灵活多样。步骤多但灵活多样。cDNAcDNA可长期保留检测可长期保留检测 多个基因。便于反应优化。在多个基因。便于反应优化。在工作的初期。工作的初期。一步法：一步法：反转录和反转录和PCRPCR扩增在同一管内完成。扩增在同一管内完成。 简便、快捷但只做一个基因，一旦失败简便、快捷但只做一个基因，一旦失败 难以查找原因。在工作的成熟阶段。难以查找原因。在工作的成熟阶段。总原则与普通总原则与普通PCRPCR相同：相同：v 避免引物二聚体，避免二级结构避免引物二聚体，避免二级结构v 扩增片段长度（扩增片段长度（80 - 300bp)80 -

30、300bp)v 推荐做跨推荐做跨intronintron设计设计引物设计原则引物设计原则Master mix的应用的应用使用使用Master mix有效降低系统误差有效降低系统误差- 热启动酶热启动酶 Hotstar 化学修饰，低温下酶活抑制性强，热复活需10min Fast Hotstar 抗体修饰，热复活仅需几十秒- Buffer 反应增强剂反应增强剂 减少模板二级结构影响 控制Mg2+浓度 稳定剂稳定剂- Dye Real SYBRGreen mix RealSuper mixMaster mix的优化的优化新型荧光染料新型荧光染料(Super Green(Super Green)激发、

31、发射波长与激发、发射波长与SYBR GreenSYBR Green近似近似对对PCRPCR反应抑制更轻微反应抑制更轻微 可使用较高浓度可使用较高浓度(1uM, SYBR green (1uM, SYBR green 0.3uM)0.3uM)更亮，灵敏度更高更亮，灵敏度更高对小片段对小片段DNADNA和和ssDNAssDNA结合更弱结合更弱 减少背景，有效信号更强减少背景，有效信号更强化学性质更稳定化学性质更稳定致突变性与毒性更弱致突变性与毒性更弱SYBR GreenSuper GreenMaster MixROX Passive Reference 不参与、不干扰不参与、不干扰PCRPCR反应

32、反应 恒定发射荧光信号恒定发射荧光信号 用于校正因信号检测器到各孔间光路不同而导致用于校正因信号检测器到各孔间光路不同而导致的系统误差。的系统误差。 有不同系统，需参照仪器要求选择。有不同系统，需参照仪器要求选择。 误差控制误差控制v 使用使用Master mixv 配置预混体系配置预混体系v 设置生物学重复（不同个体）设置生物学重复（不同个体） 技术性重复（复孔）技术性重复（复孔）v 阳性和阴性对照阳性和阴性对照 实验环境控制实验环境控制v 试剂准备区试剂准备区v 核酸制备区核酸制备区v 反应液制备区反应液制备区v 荧光定量荧光定量PCR反应区反应区荧光定量荧光定量PCRPCR体系体系 数据

33、分析数据分析 融解曲线：融解曲线：单一特异性产物单一特异性产物 扩增曲线：扩增曲线：- Ct- Ct值大小值大小- - 各复孔之间重复性各复孔之间重复性- - 不同浓度梯度稀释的间隔性不同浓度梯度稀释的间隔性 标准曲线：标准曲线：- R- R2 20.9800.980或或 r r 0.9900.990- - 反应效率尽可能高：反应效率尽可能高：90%-110%90%-110%- - 目的基因的扩增效率接近内参基因目的基因的扩增效率接近内参基因Trouble shootingHousekeeping geneHousekeeping gene 无信号无信号RNARNA降解降解用新鲜组织提取用新鲜

34、组织提取RNARNAHousekeeping gene Housekeeping gene 有信号有信号而目标基因无信号而目标基因无信号1. 1. 目的基因表达低。目的基因表达低。 逆转录效率不高逆转录效率不高2. PCR2. PCR引物不良引物不良1. 1. 富集富集mRNA mRNA 2. 2. 在逆转录中尝试不同引物，如特异引物。在逆转录中尝试不同引物，如特异引物。3. 3. 尝试不同尝试不同PCRPCR引物。减小产物大小，改换目标引物。减小产物大小，改换目标 区段，考虑不同剪接体。区段，考虑不同剪接体。4. 4. 尝试不同热循程序，降低复性温度。尝试不同热循程序，降低复性温度。Hous

35、ekeeping geneHousekeeping gene反应效率正常反应效率正常, ,但但目标因放大效率不高目标因放大效率不高PCRPCR引物不良引物不良重新设计引物，减小产物大小，改换目标区段，重新设计引物，减小产物大小，改换目标区段，考虑不同剪接体考虑不同剪接体目标基因表达丰度在目标基因表达丰度在样本之间异常一致样本之间异常一致RNARNA被基因组被基因组DNADNA污染污染1.1.使用跨使用跨intron intron 引物引物2.2.用用DNaseDNase处理处理RNARNA3.3.确保确保RNARNA阴性对照表现阴性阴性对照表现阴性溶解曲线出现杂峰溶解曲线出现杂峰1.1.出现非

36、特异出现非特异PCRPCR产物产物2.2.出现引物二聚体出现引物二聚体1.1.尝试不同尝试不同PCRPCR引物引物2.2.尝试不同热循程序，升高复性温度尝试不同热循程序，升高复性温度3.3.修改仪器设置，将检测温度设定在在引物二聚体解链修改仪器设置，将检测温度设定在在引物二聚体解链温度与温度与PCRPCR特异产物解链温度之间。特异产物解链温度之间。阴性对照在阴性对照在3030个循环个循环以内出现信号以内出现信号试剂被污染试剂被污染1.1.注意区分信号是来自引物二聚体还是注意区分信号是来自引物二聚体还是PCRPCR产物产物2.2.查找，替换污染试剂查找，替换污染试剂3.3.使用使用UNGUNG系

37、统。系统。qPCR反应优化反应优化非关键技术非关键技术外包服务外包服务Housekeeping gene 引物序列？反应条件？目标基因 引物序列？反应条件？选择试剂，摸索条件，优化参数 两个月？CoWin解决方案一：Primer assay 客户指定：物种，housekeeping gene，目标基因 客户得到：经实验优化、验证过的引物，反应条件参数，MasterMix 客户下游工作：Real-time PCR 数据获取CoWin解决方案二：全套qPCR服务 客户指定：物种，housekeeping gene，目标基因 客户提供：生物样本 客户得到：数据报告，剩余样品。 客户下游工作：写论文;得诺贝尔奖试用装领取试用装领取v网上可以享受体验价vPCR mix 5ml v质粒小提、胶回收质粒小提、胶回收 基因组提取基因组提取 2盒盒vTRIzon RNA提取试剂vSYBR green 荧光定量mixvSYBR green 荧光定量mix（with ROX）vReal super 荧光定量mixvReal super 荧光定量mix（ with ROX ）vECL 化学发光