血红素制备工艺研究进展

1、血红素制备工艺研究进展瞿桂香1,2,3,黄耀江1,2,董明盛3(1 中央民族大学,北京 100081;2 中国少数民族地区生态环境与资源保护研究所,北京 100081;3 南京农业大学,江苏南京 210095摘 要: 本文详细阐述了血红蛋白的分子结构,并从血红蛋白的分子结构出发,说明从血液中提取血红素的原理,即利用变性因素使血红蛋白的空间结构发生变化而变性,使血红素上与珠蛋白结合的化学键发生断裂,从而使血红蛋白中的血红素与珠蛋白分离;或利用各种蛋白酶在其适当pH 和温度条件下将血红蛋白上的珠蛋白水解,对酶解液的上清或沉淀进行相关处理,获得血红素.本文还对血红素提取的新老工艺以及改进方法均作了较

2、为全面的阐述.关键词: 血红素;提取;工艺中图分类号:Q819 文献标识码:A 文章编号:1005 8036(200701 0019 04收稿日期:2006 08 21基金项目:北京市教委产学研合作项目和国家985支持项目作者简介:瞿桂香(1978-,女(汉族,江苏省南京市人,中央民族大学硕士研究生,主要研究方向为动物血液的蛋白质工程. 血红素(Heme是血红蛋白、肌红蛋白和红细胞的辅基(活性部位,是一类重要的卟啉铁化合物,广泛存在于动物的血液、肌肉和某些植物组织中.在血液中它存在于红血球内与其中构成血红蛋白的组分珠蛋白以非共价键形式相结合.血红素铁在肠腔内可被肠黏膜细胞直接吸收,吸收率为25

3、%30%,且对肠道、胃壁不会造成损伤,并有较高的热安全性,因此,它广泛地应用于药品和保健食品,作为改善营养性贫血的主要原料.血红素除了作为生物铁治疗营养性贫血外,还是治疗恶性肿瘤的卟啉类药物和治疗急性、慢性迁延性、慢性活动性肝炎的原卟啉二钠盐的前体1.我国于1998年正式批准以血红素为基本原料的血卟啉为抗肿瘤新药.美国FDA 已于1983年7月正式批准雅培公司的氯化血红素作为药品使用2.在肉制品工业中,血红素也有广阔的应用前景,传统的熏制熟肉制品加工工艺中,加入的发色剂亚硝酸盐,有较大的致癌作用,血红素作为发色剂及人工色素的替代品有很高的效果3.目前,有关血红素的制备、应用与检测的报道很多,本

4、文将从血红蛋白的分子结构上对血红素的提取和改进方法加以综述,并对目前报道较少的以酶解制备血红素的方法进行较详细的叙述.1 血红蛋白的分子结构血红蛋白是结合蛋白质,其蛋白质部分称为珠蛋白,属组蛋白类,其辅基是血红素,血红素中所含的铁为二价.血红蛋白及亚基的立体结构如图1、2所示4,血红素结构如图35.血红素与珠蛋白通过四键相结合,其中两个键是血红素上的两个丙酸基与珠蛋白结合,另两个是通过铁与珠蛋白中组氨酸咪唑环的氮形成两个配位键.此配位键中的一个当血红素与氧结合时被氧化取代.珠蛋白由四条肽链(两条 链,两条 链构成, 链和 链氨基酸残基顺序不同,但两者都相似, 链的空间结构与肌红蛋白相似,盘绕成

5、8个螺旋节段(A 、B 、C 、D 、E 、F 、G 、H,而 链则盘绕成7个螺旋(A 、B 、C 、E 、F 、G 、H.这些螺旋节段之间由无规卷曲节段联结.无规卷曲分别用AB 、BC 、CD 、EF 、FG 、GH 、HC 等表示.这些节段按一定空间方位折迭就形成三级结构,其亚基再依靠次级键形成四级结构.珠蛋白含2007年2月第16卷 第1期中央民族大学学报(自然科学版Journal of the CUN(Natural Sciences EditionFeb.2007Vol.16 No.1有较多的组氨酸和赖氨酸 .图1 血红蛋白结构示意图Fi g.1 The structure of h

6、emogl obi n珠蛋白的每个亚基都与一个亚铁血红素相连.亚铁血红素位于E 、F 两个螺旋节段之间.此处有一个由疏水氨基酸残基构成的空间称为疏水口袋(Hydrophobic bag,亦称血红素口袋(He me bag.血红素分子中的Fe 2+在血红素平面的一侧与肽链中的一个组氨酸残基以配位键相连.Fe 2+和O 2相连在平面的另一侧,其邻近处有另一个组氨酸残基( 58或 63称为远心组氨酸6.亚铁血红素分子除亚铁离子以外,另一部分为原卟啉(Protoporphyrin ,它是一种重要的卟啉衍生物,在亚铁血红素中存在的是原卟啉.原卟啉上的两个N 原子与铁以共价键相结合;另外两个N 原子则以配

7、位共价键与Fe 2+相结合,整个分子处于共振状态.2 血红素提取机理从血红蛋白的结构看,在正常条件下, 亚铁血红素图2 血红蛋白 亚基的三级结构Fig.2 The thi rd structure of the chain of hemoglobin 与蛋白紧紧结合在一起,很难把它们拆分开来,但是由于变性因素(如加热,pH 变化,脲、胍等变性剂的存在,导致血红蛋白的空间结构发生变化而变性,使血红素上的丙酸基与珠蛋白结合的两个化学键及血红素中的铁与珠蛋白组氨酸咪唑环的氮形成的两个配位键断裂,从而使血红蛋白中的血红素与珠蛋白分离.利用各种蛋白酶在其适当pH 和温度条件下将血红蛋白上的珠蛋白水解,对

8、酶解液的上清或沉淀进行相关处理,获得血红素.3 血红素提取方法血红素提取方法主要有有机溶剂法、酶水 解法、图3 血红素的结构Fi g.3 The s tructure of he meCMC 法、表面活性剂法.3 1 有机溶剂法有机溶剂法主要包括冰醋酸法、丙酮法.1885年俄国学者最早在实验室内用冰醋酸,氯化钠和血共热得到血红素结晶,此后Nippe 氏在原有反应的基础上,在冰醋酸中加入少量NaCl,KCl,KBr,KI 和血共热得到血红素结晶,用此法制备少量血红素结晶速度更快,该法目前在工业上和实验室大量制备血红素的情况下仍被使用.冰醋酸法虽具有简单易行的特点,但收率低,提取温度高(10010

9、5 .血蛋白和溶20中央民族大学学报(自然科学版第16卷剂回收难,增加了生产成本,废液处理不当还会造成污染7.1975年Lindroos 等人提出了使用酸性丙酮分离提取血红素的方法,也是目前使用最多的方法.在pH 3的盐酸丙酮溶液中、亚铁血红素与珠蛋白脱离,亚铁血红素变成氯化血红素并溶于酸性丙酮溶液中,而珠蛋白则变性沉淀.具体的工艺:红细胞加适量水,进行机械搅拌细胞破碎30min 后,加入红细胞5倍体积的3%的酸性丙酮溶液,用1mol L 的盐酸调溶液的pH 值至23,抽提10min 后,离心收集上层溶液.上层溶液中加入1mol/L 的氧氧化钠(调溶液的pH 值为46、醋酸钠可得到氯化血红素结

10、晶,这种方法称为醋酸钠法;上层溶液加入5%的鞣酸也可以得到氯化血红素结晶,这种方法称为鞣酸法;或直接将上层溶液蒸馏,一方面可以得到氯化血红素,一方面也可以回收丙酮,这种方法称为蒸馏法8.目前,对提取血红素的方法进行改进的报道很多.李秀玲等9利用蛋白沉淀剂沉淀血红蛋白,可使丙酮溶剂的用量降至老工艺的一半,产品纯度可提高到99%,并且每升红细胞能得到血红素56g.宋照军等10人在溶血中加入0 15倍氯仿,可使细胞膜破裂和溶解同时进行,血红蛋白从血细胞中较完全分离出来,提高血红素的得率.王君等用超声波细胞破碎法代替机械搅拌细胞破碎法,用蒸馏法提取氯化血红素所得产品的纯度达到了96%,收率达到了90%

11、11.3 2 酶水解法这种方法没有用到有机溶剂,被认为是最环保的一种提取血红素的方法,但目前关于酶法制备血红素的报道较少.汤凤霞等人12用胰酶水解血红蛋白制备水解蛋白液,其过程是酶解液经调pH 值为4 5,然后离心分离,让血红素沉淀下来,上清液中含有的少量有色成分用活性炭吸附去除,从而获得所需的水解蛋白,但他们没有对沉淀作进一步的处理;史九根等13人比较了胰酶和细菌蛋白酶对猪血的酶解效果,通过正交实验选出最佳工艺条件,以水解度为指标,实验结果表明胰酶和蛋白酶的酶解效果都较好,并且用蛋白混合酶比单一酶效果更佳,但对酶解液中血红素的提取亦没有进一步报道.最新的报道以酶法水解血红蛋白制备血红素14,

12、具体方法是,在适当的温度和pH 条件下,先后用中性蛋白酶和风味酶进行水解,水解过程加入抗氧化剂以防止亚铁氧化成三价铁,水解程度以水解度作为指标,即氨基氮与总氮的比值百分比.然后对水解产物进行超滤,并且测定滤过液和滞留液中亚铁血红素和肽的含量,实验结果表明酶解液经10kD 滤膜超滤后再经3kD 滤膜超滤,超滤的滞留液中亚铁血红素与肽的比值达到9 92%,即制备出富亚铁血红素肽溶液,这是目前少数关于酶解制备血红素较完整的报道之一.国内也有以胃蛋白酶或动物胃粘膜制备食用血红素的专利,具体是以胃蛋白酶或动物胃粘膜将动物血的蛋白质水解,使血红蛋白所含的血红素形成不溶性胶状沉淀,通过煮沸,中和及过滤或离心

13、将血红素与蛋白水解物分离.3 3 CMC 法印韵芝等将新鲜血液离心分离出的红细胞加水溶血后再加酸(可用硫酸,调溶液pH 值为3 0,然后在酸性溶液中加入羧甲基纤维素,静置一段时间,离心分离即得到深褐色的血红素铁.得到的产品不需洗脱,将血红素和羧甲基纤维素直接作原料药压片用作抗贫血药.同时,Auto 15使用可溶性C MC 来拆分牛血红蛋白,利用C MC 稀释液加入溶血的红细胞中,结合生成C MC 血红素复合物,经离心沉淀分离.3 4 表面活性剂法该法的发明者发现,在盐酸酸化的血红蛋白溶液中加入适当的表面活性剂,然后以适当的方法加热,这时血红蛋白不会沉淀,而氯化血红素则可以从溶液中沉淀出来.如果

14、加入氯化血红素的晶种,则结晶更顺利.表面活性剂的种类可以是非离子、阳离子、两性表面活性剂或它们的混合物.除了以上方法,还有一种是碱基物 有机溶剂法16.该法为日本佐藤治男发明.用含有碱基物质的有机溶剂,使血红蛋白中的血红素与珠蛋白分解,血红素呈溶解状态,而珠蛋白则以固形物沉淀.这种方法适用于脊椎动物的血液,除了用新鲜血液外,还可以用喷雾干燥的血粉.目前,对此法报道的文献较少.此外,张炜煜等采用氯仿为溶剂,猪血粉与乙醇进行酯化反应,得血红素二乙酯,然后用氢氧化钠溶液进行水解,再用盐酸溶液酸化,将析出的晶体用水洗至中性.用此法生产的血红素其纯度可达80%以上.21 第1期瞿桂香等:血红素制备工艺研

15、究进展22中央民族大学学报(自然科学版第16卷 这是国内关于血红素提取方法的最新报道.4 问题和展望尽管血红素提取的方法有所改进,但要真正应用于生产需要考虑以下几个问题:一、降低成本;二、提取的过程中尽量避免使用毒性较大、难以回收的有机溶剂,做到环保生产.而用于食品或作为铁强化剂更重要的是考虑其安全性,有机溶剂残留给健康造成隐患,因此不使用有机溶剂的酶解制备血红素的方法将是发展的方向,但是此方法还不成熟,尤其是血红素的氧化以及溶解性问题,寻找合适的抗氧化剂或还原剂以及考虑微囊化改善溶解性等还有待进一步实验研究.参考文献:1 周淡宜,徐水祥,等.血红素纯化技术研究J.药物生物技术,2004,11

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