骨髓增生异常综合征患者血清造血抑制活性的研究

1、    骨髓增生异常综合征患者血清造血抑制活性的研究        摘要目的探讨骨髓增生异常综合征(MDS)患者血清对正常骨髓粒系及红系造血祖细胞的抑制作用。方法应用甲基纤维素体外培养法，以DNA末端标记及流式细胞术分析观察患者血清体外抑制正常人骨髓造血祖细胞增殖及对正常人造血细胞凋亡的作用。结果23例患者中有3例的血清具有抑制正常骨髓粒系祖细胞生长的作用，4例血清具有抑制正常骨髓红系祖细胞生长的作用。4例对正常骨髓红系祖细胞生长有抑制作用的患者中有3例患者血清的抑制活性可被

2、抗肿瘤坏死因子(TNF)单克隆抗体中和。2例具有抑制正常骨髓红系祖细胞生长活性的血清在体外可促进正常骨髓造血细胞凋亡。结论部分MDS患者血清中存在造血抑制因子，这种抑制因子主要是TNF，TNF诱导造血细胞凋亡是致部分MDS患者无效造血的重要原因。关键词造血系统肿瘤坏死因子细胞死亡，程序性骨髓增生异常综合征Inhibition of hematopoiesis by sera from patients with myelodysplastic syndromesDING Runsheng,LIU Hong,XU Ruirong,et al.Department of Hematology,Th

3、e Affiliated Hospital of Nantong Medical College,Nantong226001AbstractObjectiveTo explore the inhibitory effect of sera from patients with myelodysplastic syndromes (MDS) on the growth of normal hematopoietic progenitor cells.MethodsThe inbibitory activity to the growth of BFU-E and CFU-GM was analy

4、sed by in vitro methylcellulose culture.Hematopoietic cell apoptosis was assayed with a programed cell death assay kit and flow cytometry.ResultsIn the 23 MDS patients studied，a potent inhibitory activity to CFU-GM and BFU-E was demonstrated in 3 and 4 patients,respectively.The inhibitory activity t

5、o BFU-E of sera from 3 patients was almost entirely neutralized by anti-TNF McAb.Sera from two MDS patients induced apoptosis of normal hematopoietic progenitor cells.ConclusionInhibitors of hematopoietic progenitor cells are present in sera from some MDS patients. One of the inhibitors might be TNF

6、, which can induce apoptosis, resulting in ineffective hematopoiesis in MDS.Key wordsHematopoietic systemTumor necrosis factorCell death,programedMyelodysplastic syndrome骨髓增生异常综合征(MDS) 是一组造血干细胞克隆性疾病1,2。骨髓细胞常增生，但由于无效造血,外周血有一系、两系或三系血细胞减少。从体液因素讨论其骨髓无效造血的原因，也许能更好地了解MDS的发病机制。曾有MDS患者血清造血抑制作用的报道3,但血清中抑制物的性

7、质尚无统一结论，其作用机制尚不清楚。我们观察MDS患者血清对正常造血细胞的抑制活性，并进一步探讨抑制物的特性。病例和方法1病例MDS患者23例，男11例，女12例，年龄3078岁，平均51.2岁；其中RA 12例，RAS 3例，RAEB 5例和RAEB-t 3例，均按FAB诊断标准4确诊。所有病例都有不同程度的贫血。实验前，所有病例未经任何治疗。以10名正常志愿者为供体，取其骨髓作为红系爆式集落(BFU-E)及粒-巨噬细胞集落(CFU-GM)的来源。2血清标本取患者及正常对照者的外周血适量，室温静置1小时后离心。将血清分装于试管中，-30冻存备用。3单个核细胞(MNC)分离取正常人肝素抗凝骨髓

8、适量，以Ficoll液(相对密度为1.077) 密度梯度法分离MNC作培养用。部分骨髓的MNC进一步以塑料皿吸附法除去单核细胞，以尼龙纤维(日本Wakojunyakm会社)去除B淋巴细胞，以E玫瑰花环法除去T淋巴细胞，再做培养5。4甲基纤维素体外培养按Iscove法6改良：将正常供体骨髓分离所得MNC加入培养体系中，细胞终浓度为2×105/ml。BFU-E体系含12g/L甲基纤维素,体积分数为30的灭活胎牛血清，体积分数为1的牛血清清蛋白，10ng/ml的白细胞介素3(购自日本Kirin公司)，450ng/ml转铁蛋白(购自美国Sigma公司)，2U/ml红细胞生成素(购自Kirin

9、公司)及IMDM培养液。CFU-GM培养体系含12g/L甲基纤维素，体积分数为30的热灭活胎牛血清，体积分数为1的牛血清清蛋白，10ng/ml白细胞介素3，10ng/ml粒系集落刺激因子(购自Kirin公司)及IMDM培养液。每份标本一式两份，37、体积分数为5的CO2及饱和湿度下培养14天，分别计算BFU-E及CFU-GM的数量。5血清抑制活性分析患者及正常人血清以56灭活补体，再分别加至正常人骨髓MNC悬液中，按以上方法培养。血清终浓度体积分数为10。患者血清抑制活性以百分恢复率(PR)表示。PR计算见下列公式：    按照Poisson分布原理进行

10、u检验,BFU-E的PR81.5，CFU-GM的PR79.0可定为具有集落抑制活性。6血清中和试验按Tohda等的方法7进行。将各血清标本分别与抗干扰素单克隆抗体(单抗)、抗肿瘤坏死因子(TNF)单抗孵育1小时后再加入MNC悬液中，按以上方法进行培养。7细胞凋亡的诱导及测定将患者及正常人血清分别加至含正常人MNC的IMDM培养液中，细胞终浓度为2×105/ml，37、体积分数为5的CO2及饱和湿度下培养48小时，分别进行DNA末端标记(ISEL)染色及细胞DNA测定。前者按程序性细胞死亡药盒（华美生物工程公司）操作说明进行。后者主要操作过程如下：细胞经PBS洗涤后以100U/ml R

11、Nase消化，并以50g/ml碘化丙锭染色15分钟，流式细胞仪(Becton Dickinson公司产品)检测细胞DNA含量并计算凋亡细胞的数量。8统计分析数据以<"wpe8.jpg (766 bytes)" src="/med/cano/201003/20100317174019496.jpg" 13 21>±s表示,按照Poisson分布原理进行u检验。结果1血清的造血抑制活性23例患者中有4例血清具有红系造血抑制活性，他们的PR分别为34.6，58.7，48.4和52.1。3例血清具有粒系造血抑制活性，他们的PR分别为39.4

12、，52.8和44.6。2单抗对血清抑制活性的中和作用患者血清的造血抑制活性都不能被干扰素单抗中和。TNF单抗可完全中和3例患者血清对BFU-E的抑制活性(表1)。表1TNF单抗对3例患者血清抑制活性的中和作用(<"wpe9.jpg (766 bytes)" src="/med/cano/201003/20100317174020592.jpg" 13 21>±s)例号实验次数BFU-E PR(%)中和前中和后1334.6±2.390.8± 4.52348.4±7.294.6± 2.93252.

13、1±3.983.2±11.3正常对照5100.0±0.2100.0±1.8     3患者血清对正常骨髓MNC凋亡的影响具有造血抑制活性的患者血清与正常骨髓MNC共育48小时后，分别用DNA ISEL和流式细胞术(FCM)检测凋亡细胞。在ISEL方法中，我们应用的底物为联苯二胺，故凋亡细胞的特征是细胞核中有棕色颗粒或核被着棕色。应用Poisson分布统计分析表明，具有红系造血抑制活性的4例患者中2例患者血清作用后计数500个细胞中凋亡细胞百分率为12. 3和10.6，与正常血清作用后计数500个细胞中凋亡细胞百分率

14、1.2相比，差异有显著性(u=3.02,u=2.73,P0.01)。以流式细胞仪测定细胞的凋亡峰(1),经2例患者血清作用后细胞凋亡率为14.2和12.7，均较正常人血清作用后的细胞凋亡率(1.4)为高,患者血清明显促进正常骨髓MNC凋亡(u=3.24,u=2.75,P0.01)。 讨论曾有学者发现，部分MDS患者血清具有造血抑制活性3，这种抑制活性可能是引起部分患者血液学异常的原因。我们测定了23例患者血清的造血抑制活性。结果显示3例患者血清具有粒系造血抑制活性，4例患者血清具有红系造血抑制活性。因而证实了部分患者的发病机制与患者血清的造血抑制因子对造血祖细胞生长的抑制作用有关。正常造血的调

15、节有赖于造血刺激因子和造血抑制因子的平衡。作为造血负调控因子的TNF在MDS的病理学过程中的作用日益受到关注。TNF体外能抑制正常红系和粒系集落生长。本实验中有4例患者血清具有红系造血抑制活性，用抗TNF单抗可中和其中3例患者血清对BFU-E的抑制活性。表明部分患者血清中的造血抑制物是TNF。MDS作为一种克隆性疾患，TNF在造血调控过程中可能优先产生红系造血抑制。     1正常人及2例MDS患者血清对正常骨髓MNC凋亡的影响Raza等8观察到患者骨髓活检片中ISEL阳性细胞周围有大量TNF。为了探讨TNF与MDS无效造血之间的关系，我们分别以DNA原

16、位末端标记及流式细胞术分析观察了患者血清对正常人骨髓MNC凋亡的影响。实验结果证实了2例患者血清有明显促进正常人MNC凋亡的作用，表明血清中的造血抑制物其实质是TNF，加速造血细胞凋亡的作用在该2例患者尤其明显。随后Raza等9又证实,MDS患者骨髓微环境中存在的TNF具有双重作用,在诱导正常细胞凋亡的同时又刺激异常克隆细胞的增殖。由此我们认为,MDS是正常造血和异常克隆同时存在的异质性疾病,正常造血受抑可能是异常克隆增殖的条件之一。因此,TNF抑制正常造血，促进细胞凋亡在MDS患者骨髓无效血细胞生成中起重要作用，这可能是该病患者骨髓异常细胞增生而外周血全血细胞减少这一矛盾现象的原因之一。设想

17、TNF的抑制剂或可溶性TNF受体的体内应用，将有可能为造血细胞因子调控和MDS的个体化治疗提供一条新思路。作者单位：丁润生刘红徐瑞荣吴芳颐226001江苏省南通市，南通医学院附属医院血液科参考文献1Tdfferi A,Thibodeau SN,Solberg LA Jr.Clonal studies in the myelodysplastic syndrome using X-linged restriction fragment lengthpolymorphisms.Blood,1990,75:1770-1773.2Asano H,Ohasi H,Ichihara M,et al.Evi

18、dence for nonclonal hematopoietic progenitor cell populations in bone marrow of patients with myelodysplastic syndromes.Blood,1994,84:588-594.3刘明漪，唐华阳，吴谨绪，等.再生障碍性贫血与骨髓增生异常综合征发病机理的初步探讨与比较.中华血液学杂志,1989,10:83-84.4Bennet JM,Catovsky D,Daniel MT,et al.Proposals for the classification of the acute leukaem

19、ias.French-American-British (FAB) Co-operative Group.Br J Haematol,1976,33:451-458.5Liu H,Ozaki K,Matsuzaki Y,et al.Suppression of haematopoiesis by IgG autoantibodies from patients with systemic lupus erythematosus(SLE).Clin Exp Immunol,1995,100:480-485.6Iscove NN,Sieber F,Winterhalter KH,et al.Erythroid colony formation in culture of mouse and human bone marrow:analysis of the requirement for erythropoietin by gel filtration and affinity chromalography on agarose concanavalin A.J