仪器分析(第3章高效液相色谱分析)课件

1、仪器分析教程Instrumental Analytical 仪器仪器 高效液相色谱分析高效液相色谱分析High Performance Liquid High Performance Liquid Chromatography,HPLCChromatography,HPLC第第 3 3 章章(第五讲）仪器分析教程内容提要内容提要1 1 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点2 2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素影响色谱峰扩展及色谱分离的因素3 3 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理高效液相色谱法的主要类型及其分离原理4 4 液相色谱法的固定相液相色谱法的固定相5 5 液相色谱法流动相液相色

2、谱法流动相6 6 高效液相色谱仪高效液相色谱仪7 7 高效液相色谱分离类型的选择高效液相色谱分离类型的选择8 8 高效液相色谱法应用实例高效液相色谱法应用实例9 9 液相制备色谱液相制备色谱10 10 毛细管电泳毛细管电泳仪器分析教程3.13.1高效液相色谱的特点高效液相色谱的特点一、定义：液相色谱法是指一、定义：液相色谱法是指流动相为液体流动相为液体的色谱技术。的色谱技术。高效液相色谱是高效液相色谱是2020世纪世纪7070年代迅速发展起来的一项年代迅速发展起来的一项高效、快速的分离技术。（液相色谱高效、快速的分离技术。（液相色谱+ +气相色谱理气相色谱理论论+ +高压泵、高效固定相高压泵、

3、高效固定相+ +高灵敏检测器）。高灵敏检测器）。二、特点二、特点1.1.高压高压: : 可达可达150350105 Pa2.2.高速高速: : 例，分离例，分离2020种氨基酸，经典色谱法要种氨基酸，经典色谱法要2020多小多小时，用时，用HPLCHPLC只需只需1 1小时小时. .3.3.高效高效：3 3万塔板万塔板/ /米（米（GC2000GC2000塔板塔板/ /米）米）4.4.高灵敏度高灵敏度： 紫外检测器紫外检测器1010-9-9 g g；荧光检测器；荧光检测器1010-11-11g g仪器分析教程三、应用范围三、应用范围 气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。气相色谱仅

4、能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，定程度的限制，据统计只有大约据统计只有大约20%20%的有机物能用气相色谱分的有机物能用气相色谱分析析；而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非；而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，

5、大约离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的占有机物的70 - 70 - 80%80%。 。 因此，高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不因此，高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，不受试样挥发性的限制。需要气化，不受试样挥发性的限制。仪器分析教程 与与GC GC 比较比较65/165/1；基本概念及理论基础与；基本概念及理论基础与GCGC一致；一致；主要区别：流动相不同主要区别：流动相不同. .影响的因素：柱内展宽和影响的因素：柱内展宽和柱外展宽柱外展宽。一、柱内展宽一、柱内展宽1.1.涡流扩散项涡流扩散项 ： H He e = 2d = 2dp p : :填充不均匀

6、因子；填充不均匀因子；d dp p填充粒度直径填充粒度直径 高效液相色谱法的固定相是高效填料，其颗粒直高效液相色谱法的固定相是高效填料，其颗粒直径比气相色谱法更小；且装柱多采用匀浆法装柱，径比气相色谱法更小；且装柱多采用匀浆法装柱，填充很均匀，填充很均匀， 变得很小，所以变得很小，所以H He e值比较小。值比较小。3.2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素影响色谱峰扩展及色谱分离的因素仪器分析教程2.2.纵向扩散项纵向扩散项65/-165/-1： H Hd d = C = Cd dD Dm m/u/u； 当试样分子在色谱柱内被流动相带向前时，由当试样分子在色谱柱内被流动相带向前时，由于分子本身运动

7、所引起的纵向扩散同样引致色于分子本身运动所引起的纵向扩散同样引致色谱峰的扩展。由于分子在液体中的扩散系数谱峰的扩展。由于分子在液体中的扩散系数DmDm比在气体中小比在气体中小4-54-5个数量级，个数量级，在在LCLC中可忽略中可忽略,GC,GC中重要。中重要。 仪器分析教程3、传质阻力项、传质阻力项 组分分子在固定相与流动相之间传质缓慢引起局部不平衡，组分分子在固定相与流动相之间传质缓慢引起局部不平衡，从而引起峰扩展。从而引起峰扩展。（1 1）固定相传质阻力项（主要发生在液液分配色谱中）固定相传质阻力项（主要发生在液液分配色谱中） 当流动相中的试样分子扩散进入到涂渍在载体表面的固当流动相中的

8、试样分子扩散进入到涂渍在载体表面的固定液内进行质量交换时，由于渗入固定液膜的深度不同，定液内进行质量交换时，由于渗入固定液膜的深度不同，其返回到流动相中的时间也不同，因而引起峰扩展。其返回到流动相中的时间也不同，因而引起峰扩展。扩散系数。试样分子在固定液内的固定液的液膜厚度。容量因子）有关的系数是与式中sfssfssdkDdCHD(C)33(2仪器分析教程 采取措施：采取措施： 1 1）液）液- -液分配色谱：薄的固定相层；吸附、排液分配色谱：薄的固定相层；吸附、排阻、离子交换色谱：小的颗粒填料。阻、离子交换色谱：小的颗粒填料。 2 2）采用扩散系数大的液相固定相。）采用扩散系数大的液相固定相

9、。 3 3）减小流动相的流速，改善传质。）减小流动相的流速，改善传质。仪器分析教程（2 2）流动相传质阻力项）流动相传质阻力项( (二种形式二种形式: :在流动的流动相中的传在流动的流动相中的传质和滞留的流动相中的传质质和滞留的流动相中的传质) ) i. i.流动的流动相中的传质阻力项流动的流动相中的传质阻力项H Hm m 当流动相流经色谱柱内的填充物时，靠近填充物颗粒当流动相流经色谱柱内的填充物时，靠近填充物颗粒表面的流速较慢，而流路通道中心的流速则较快，表面的流速较慢，而流路通道中心的流速则较快，移动移动速度不一样速度不一样从而引起峰形变宽。从而引起峰形变宽。.D(C)43(2流动相线速度

10、扩散系数。试样分子在流动相中的固定相的粒度。容量因子）函数。是与式中udkuDdCHmmmmpmm仪器分析教程 ii.ii.滞留的流动相中的传质阻力项滞留的流动相中的传质阻力项H Hsmsm 由于固定相的多孔性能使流动相滞留在其微孔内，微孔内由于固定相的多孔性能使流动相滞留在其微孔内，微孔内的流动相称为滞留区流动相（静止状态，不流动）。当流动的流动相称为滞留区流动相（静止状态，不流动）。当流动相中的试样分子与固定相进行质量交换时，必须先从流动相相中的试样分子与固定相进行质量交换时，必须先从流动相扩散进入到滞留区。如果固定相中微孔既小又深，则滞留就扩散进入到滞留区。如果固定相中微孔既小又深，则滞

11、留就越严重，传质就越慢，对峰扩展影响也越大。越严重，传质就越慢，对峰扩展影响也越大。.D,C)43(2流动相线速度扩散系数。试样分子在流动相中的固定相的粒度。分数及容量因子有关。相所占据部分的它与颗粒微孔中被流动是一常数式中uduDdCHmmsmmpmssm仪器分析教程 由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化可归由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化可归纳为：纳为： H=A+B/u+CuH=A+B/u+Cu 由于由于B/uB/u这一项可以忽略不计，影响柱效的主要因这一项可以忽略不计，影响柱效的主要因素是传质阻力项素是传质阻力项，高效液相色谱的方程可写成：，高效液相色谱的方程可写成： H=A

12、+CuH=A+Cu)63()(2:222uDdCDdCDdCudCdHsfsmpmsmpmmdp板高度的总变化色谱峰扩展所引起的塔仪器分析教程1. 1. 固定相与装柱方法的选择：固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相选粒径小的、分布均匀的球形固定相 （dp10m,5mdp10m,5m目前应用最广泛）目前应用最广泛） 首选化学键合相，匀浆法装柱首选化学键合相，匀浆法装柱2. 2. 流动相及其流速的选择：流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相选粘度小、低流速的流动相甲醇，甲醇， 约约1ml/min 1ml/min 3. 3. 柱温的选择：选室温柱温的选择：选室温252

13、5左右左右其中，减小粒度是提高柱效能的最有效的方法。其中，减小粒度是提高柱效能的最有效的方法。仪器分析教程HPLCHPLC与与GCGC的的H-uH-u曲线见曲线见图图3-13-1：（1 1）两者曲线形状相）两者曲线形状相似，都有一个似，都有一个H H最小值；最小值；（2 2）HPLCHPLC的的H H最小值比最小值比GCGC的最小值小一个数量的最小值小一个数量级以上，柱效更高；级以上，柱效更高；（3 3） HPLCHPLC的最佳流速的最佳流速u u比比GCGC的最佳流速的最佳流速u u也小也小一个数量级以上。一个数量级以上。仪器分析教程二、柱外展宽：指色谱柱外各种因素引起的峰扩二、柱外展宽：指

14、色谱柱外各种因素引起的峰扩展展. . a. a.柱前展宽：主要由进样所引起；柱前展宽：主要由进样所引起； 进样方式：将试样注入色谱柱的顶端滤塞上或进样方式：将试样注入色谱柱的顶端滤塞上或注入进样器的液流中。注入进样器的液流中。 由于进样器的死体积以及进样时的液流扰动引由于进样器的死体积以及进样时的液流扰动引起色谱峰不对称和展宽。起色谱峰不对称和展宽。 解决：试样注入柱顶端中心点或填料中心解决：试样注入柱顶端中心点或填料中心12mm处。处。 b.b.柱后展宽：主要由接管、检测器流通池体积柱后展宽：主要由接管、检测器流通池体积所引起所引起. . 解决：连接管的体积、检测器的死体积应尽可解决：连接管

15、的体积、检测器的死体积应尽可能小能小. . 3.33.3高效液相色谱的主要类型及其分离原理高效液相色谱的主要类型及其分离原理类型类型：液：液- -液色谱；液液色谱；液- -固色谱；离子交换色谱；离子对色固色谱；离子交换色谱；离子对色谱；离子色谱；空间排阻色谱谱；离子色谱；空间排阻色谱一一. .液液- -液分配色谱法及化合键合相色谱液分配色谱法及化合键合相色谱 1.1.特点特点：a.a.流动相和固定相都是液体流动相和固定相都是液体 b.b.两相应互不相溶，有明显的分界面两相应互不相溶，有明显的分界面 2.2.分离机制：试样组分溶于流动相后分离机制：试样组分溶于流动相后, ,在固定相和流动相在固定

16、相和流动相之间的相对之间的相对溶解度存在差异溶解度存在差异，溶质在两相间进行分配。，溶质在两相间进行分配。 K = cs/cm = kVm/Vs 分离的顺序分离的顺序决定于分配系数的大小，分配系数大的组分决定于分配系数的大小，分配系数大的组分保留值大保留值大. .而且流动相的种类对分配系数也有较大的影响而且流动相的种类对分配系数也有较大的影响. . 3.3.解决固定液流失问题方法：解决固定液流失问题方法：1 1）采用正或反相色谱）采用正或反相色谱 a.a.正相液正相液- -液色谱法液色谱法：流动相的极性：流动相的极性小于小于固定液固定液的极性（固定液：亲水性；流动相：疏水性）的极性（固定液：亲

17、水性；流动相：疏水性） b.b.反相液反相液- -液色谱法液色谱法：流动相的极性：流动相的极性大于大于固定液固定液的极性（固定液：疏水性；流动相：亲水性）的极性（固定液：疏水性；流动相：亲水性）2 2）采用化学键合固定相）采用化学键合固定相 化学键合固定相化学键合固定相：将各种不同有机基团通过化：将各种不同有机基团通过化学反应共价键合到硅胶（担体）表面的游离羟学反应共价键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上，代替机械涂渍的液体固定相基上，代替机械涂渍的液体固定相. . 目前反相键合相色谱法，已成为高效液相色谱目前反相键合相色谱法，已成为高效液相色谱中应用最广泛的一个分支，液中应用最广泛的一个分支，

18、液- -液分配色谱极少液分配色谱极少采用。采用。二二. .液液- -固色谱法（或液固色谱法（或液- -固吸附色谱法）固吸附色谱法）1.1.特点特点：流动相为液体，固定相为吸附剂。：流动相为液体，固定相为吸附剂。2.2.分离机制：根据物质吸附作用的不同来进行分离。分离机制：根据物质吸附作用的不同来进行分离。（溶质分子（溶质分子X X与溶剂分子与溶剂分子S S对吸附剂表面竞争吸附）对吸附剂表面竞争吸附） X Xm m + nS + nSa a = X= Xa a + + nSnSm m K = X K = Xa aSSm m n n / X / Xm mSSa a n n 3.3.结论结论69/-

19、569/-5： 显然，分配系数大的组分，吸附剂对显然，分配系数大的组分，吸附剂对它的吸附力强，保留值就大它的吸附力强，保留值就大. .4.4.作用作用：a.a.适用分离相对分子质量中等油性试样。适用分离相对分子质量中等油性试样。 b.b.对具有不同官能团的化合物和异构体有较对具有不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性。高的选择性。 缺点缺点：由于非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象：由于非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象. . 三、离子对色谱法三、离子对色谱法 1.1.特点特点：对各种强极性的有机酸或有机碱的分离，分离效能：对各种强极性的有机酸或有机碱的分离，分离效能高，分析速度快，操作简便高，分

20、析速度快，操作简便. . 2. 2.分离机制分离机制（P71P71）：将一种或多种与溶质电荷相反的离子）：将一种或多种与溶质电荷相反的离子（称为对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶（称为对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。保留行为。 3.3.分离过程分离过程：流动相中待分离有机离子与固定相或流动相中：流动相中待分离有机离子与固定相或流动相中带相反电荷的对离子结合，形成离子对化合物，然后在两相带相反电荷的对离子结合，形成离子对化合物，然后在两相间进行分配间进行分配

21、. . X X+ +水相水相 ( (被测离子被测离子)+ Y)+ Y水相水相( (对离子对离子) ) X X+ +Y Y有机有机相相 K KXYXY= = X X+ +Y Y 有机相有机相 / / X X+ + 水相水相 Y Y 水相水相（平衡常数）（平衡常数） D DX X = = X X+ +Y Y 有机相有机相 / X/ X+ +水相水相 = K= KXYXY Y Y 水相水相（分配系数）（分配系数）4.4.离子对色谱法分类离子对色谱法分类 正相离子对色谱法正相离子对色谱法( (极性固定相）极性固定相） 反相离子对色谱法（非极性的疏水固定相，含有对离子反相离子对色谱法（非极性的疏水固定相

22、，含有对离子Y Y的甲醇水（或乙腈水）溶液作为极性流动相）的甲醇水（或乙腈水）溶液作为极性流动相）试样离子试样离子X X进入柱内以后，与对离子进入柱内以后，与对离子Y Y生成疏水性离子生成疏水性离子对对X XY Y，后者在疏水性固定相表面分配或吸附。，后者在疏水性固定相表面分配或吸附。5.5.应用应用：解决了以往难分离混合物的分离问题：解决了以往难分离混合物的分离问题, ,诸如酸、碱诸如酸、碱和离子、非离子混合物，特别是一些生化试样和离子、非离子混合物，特别是一些生化试样. .)133()1.1 ()121 (1.水相水相YKuLtYKVVDkXYRXYMSx可见保留值随KXY和Y-水相的增大

23、而增大。四四. .离子交换色谱法离子交换色谱法 1.1.分离机制分离机制70/270/2；离子交换树脂上可电离的离子；离子交换树脂上可电离的离子 与流动相与流动相中具有相同电荷的溶质离子中具有相同电荷的溶质离子 进行可逆交换，依据这些离进行可逆交换，依据这些离子对交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。子对交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。 2.2.适用范围适用范围70/370/3；凡能在溶剂中电离的物质一般；凡能在溶剂中电离的物质一般 均可用该均可用该法进行分离。法进行分离。离子交换树脂固定相上带电荷基团或游离的离子交换树脂固定相上带电荷基团或游离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子发生可逆

24、交换反离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子发生可逆交换反应：应： )83()73(N3NM443树脂）（树脂）阴离子交换：树脂）（树脂）（阳离子交换：NRXClNRClXSOMaSOa仪器分析教程3.分离分离交换交换： KX = - NR4+X-Cl- / - NR4+Cl-X- DX =- NR4+X-/X-= KX- NR4+Cl-/Cl- 4.结论结论：a.分配系数分配系数D愈大，表示溶质的离子与离愈大，表示溶质的离子与离子交换剂的相互作用愈强。子交换剂的相互作用愈强。 b.亲合力高的，在柱中保留值就愈大亲合力高的，在柱中保留值就愈大. 5.应用应用：a.分离离子或可离解的化合物。分离离

25、子或可离解的化合物。 b.已成功地分离氨基酸、核酸、蛋白质等已成功地分离氨基酸、核酸、蛋白质等.仪器分析教程五、离子色谱法五、离子色谱法这是这是20世纪世纪70年代中期发展年代中期发展起来的一项新的液相色谱法，起来的一项新的液相色谱法，很快发展成为水溶液中阴离子很快发展成为水溶液中阴离子分析的最佳方法。分析的最佳方法。 1.固定相固定相:离子交换树脂离子交换树脂 流动相流动相:电解质溶液电解质溶液 检测器检测器:电导检测器电导检测器 主配件：抑制柱（抑制流动相主配件：抑制柱（抑制流动相中强电解质背景离子的干扰）中强电解质背景离子的干扰） 2. 流程图：流程图：fig3-2例：例：阴离子交换柱（

26、分离柱）：阴离子交换柱（分离柱）：ROH + Na+Br-(待测待测) RBr- + Na+OH-（交换）（交换）R RBr-Br- + Na+OH+ Na+OH ( (洗洗脱剂脱剂) ) R ROH-+ Na+ Br-OH-+ Na+ Br-（洗（洗脱脱）抑制柱（消除本底电导影响），则发生下列反应：抑制柱（消除本底电导影响），则发生下列反应：RH + Na+OH-(流动相流动相) RNa+ + H2O RH + Na+Br-(流动相流动相) RNa+ + H+Br-可见，不仅大量碱转化为低电导的水，而且待测离子转化为具有可见，不仅大量碱转化为低电导的水，而且待测离子转化为具有更大淌度的酸，大

27、大提高检测灵敏度。更大淌度的酸，大大提高检测灵敏度。3.3.分离机制分离机制 a.a.双柱型：化学抑制型离子色谱法；双柱型：化学抑制型离子色谱法； b.b.单柱型：非抑制型，用低电导的洗脱液；单柱型：非抑制型，用低电导的洗脱液； 4.4.应用应用： 离子色谱法是目前唯一快速、灵敏和准确离子色谱法是目前唯一快速、灵敏和准确的多组分分析的方法因而得到广泛重视和迅速的多组分分析的方法因而得到广泛重视和迅速发展。从无机和有机阴离子到金属阳离子，从发展。从无机和有机阴离子到金属阳离子，从有机阳离子到糖类、氨基酸等均可用该法分析有机阳离子到糖类、氨基酸等均可用该法分析. .六、空间排阻色谱法六、空间排阻色

28、谱法 1.1.固定相：凝胶固定相：凝胶 2.2.机制机制73/-973/-9：类似于分子筛作用，分离只与：类似于分子筛作用，分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流体力学体积和分凝胶的孔径分布和溶质的流体力学体积和分子大小有关子大小有关. . 排阻法是建立在分子大小的基础上的。组分排阻法是建立在分子大小的基础上的。组分中太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，先中太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，先出峰；组分中太小的分子可以进入所有胶体出峰；组分中太小的分子可以进入所有胶体微孔中，最后出峰。微孔中，最后出峰。 洗脱次序将取决于相对分子质量的大小，相洗脱次序将取决于相对分子质量的大小，相对分子质量大的先洗脱，

29、相对分子质量小的对分子质量大的先洗脱，相对分子质量小的后洗脱。后洗脱。 分子的形状也对保留有重要的作用。分子的形状也对保留有重要的作用。仪器分析教程3.分离示意图，分离示意图，fig3-3 a.排斥极限排斥极限A点点74/2;3: b.全渗透极限全渗透极限B点点74/2;6: 相对分子质量介于上述相对分子质量介于上述 两个极限之间的化合物，两个极限之间的化合物， 将按相对分子质量降低的将按相对分子质量降低的 次序被洗脱而可以分离次序被洗脱而可以分离. 4.特点特点75/2;3:1）试样色谱峰全部在溶剂的保留时）试样色谱峰全部在溶剂的保留时间前出峰。间前出峰。2）用于分离相对分子质量大的化合）用

30、于分离相对分子质量大的化合物（约为物（约为2000以上）；以上）；3）只能分离相对分子质）只能分离相对分子质量差别在量差别在10%以上的分子。以上的分子。3.4 3.4 液相色谱法固定相液相色谱法固定相 色谱柱是色谱法的心脏，固定相及装柱技术是关键色谱柱是色谱法的心脏，固定相及装柱技术是关键. .一、液一、液- -液色谱法、键合相色谱法及离子对色谱法固定相液色谱法、键合相色谱法及离子对色谱法固定相1.1.全多孔型担体：直径小于全多孔型担体：直径小于1010m,m,由由nmnm级的硅胶微粒堆聚而级的硅胶微粒堆聚而成为成为5 5m m直径的全多孔型担体。颗粒小，柱效高。直径的全多孔型担体。颗粒小，

31、柱效高。2.2.表层多孔型担体：直径为表层多孔型担体：直径为30304040m m的实心核的实心核( (玻璃微珠玻璃微珠) )，表层上附有一层厚度约为表层上附有一层厚度约为1 12 2 m m的多孔硅胶，填柱容易，的多孔硅胶，填柱容易，重现性好，但试样容量低。目前重现性好，但试样容量低。目前5 510m m直径是使用最广泛直径是使用最广泛的高效填料。的高效填料。3.3.化学键合固定相（化学键合固定相（P76P76及及P69P69） 定义：用化学反应的方法通过化学键把有机分子结合到担定义：用化学反应的方法通过化学键把有机分子结合到担体表面体表面. . 化学键合固定相化学键合固定相 根据在硅胶表面

32、的化学反应不同，键合固定相根据在硅胶表面的化学反应不同，键合固定相可分为：硅氧碳键型（可分为：硅氧碳键型（Si-O-C)Si-O-C)；硅氧硅碳；硅氧硅碳键型（键型（Si-O-Si-C);Si-O-Si-C);硅碳键型（硅碳键型（Si-C)Si-C)；硅；硅氮键型（氮键型（Si-N)Si-N)。 硅烷化反应：硅烷化反应：化学键合固定相的特点：化学键合固定相的特点： （1 1）表面没有液坑，比一般液体固定相传质快得多；）表面没有液坑，比一般液体固定相传质快得多； （2 2）无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命；）无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命； （3 3）可以键合不同的官能团，能灵

33、活地改变选择性，）可以键合不同的官能团，能灵活地改变选择性，应用于多种色谱类型及样品的分析；应用于多种色谱类型及样品的分析； （4 4）有利于梯度洗提，也有利于配用灵敏的检测器和）有利于梯度洗提，也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集。馏分的收集。分离机制分离机制77/277/2：既不是全部吸附过程，亦不是典型的液：既不是全部吸附过程，亦不是典型的液- -液分配过程，而是双重机制兼而有之，只是按键合量液分配过程，而是双重机制兼而有之，只是按键合量的多少而各有侧重的多少而各有侧重. .二、液二、液- -固吸附色谱法固定相固吸附色谱法固定相 目前较常用目前较常用5-105-10m m的硅胶微粒（全多

34、孔型）的硅胶微粒（全多孔型）. .三、离子交换色谱法固定相三、离子交换色谱法固定相 1.1.薄膜型离子交换树脂，以薄壳玻珠为担体，表面涂薄膜型离子交换树脂，以薄壳玻珠为担体，表面涂1%1%离子离子交换树脂交换树脂. . 2. 2.离子交换键合固定相：用化学反应将离子交换基团键合在离子交换键合固定相：用化学反应将离子交换基团键合在惰性担体表面。惰性担体表面。 a.a.键合薄壳型：担体，薄壳玻珠；键合薄壳型：担体，薄壳玻珠； b.b.键合微粒担体型：担体，微粒硅胶键合微粒担体型：担体，微粒硅胶. .四、排阻色谱法固定相四、排阻色谱法固定相 a.a.软质凝胶：葡萄糖凝胶；琼脂糖凝胶；软质凝胶：葡萄糖

35、凝胶；琼脂糖凝胶；( (水流动相水流动相, ,常常压压) ) b. b.半硬质凝胶：交联聚苯乙烯凝胶；半硬质凝胶：交联聚苯乙烯凝胶；( (有机溶剂，较高压有机溶剂，较高压) ) c. c.硬质凝胶：多孔硅胶；多孔玻珠；硬质凝胶：多孔硅胶；多孔玻珠；( (高速高速) )仪器分析教程3.5 液相色谱法流动相液相色谱法流动相1.重要性：重要性：GC载气仅三四种，要提高柱效选载气仅三四种，要提高柱效选择性，主要是改变固定相的性质；择性，主要是改变固定相的性质； LC则不同，当固定相选定时，流动相的种则不同，当固定相选定时，流动相的种类，配比能显著地影响分离效果，因此类，配比能显著地影响分离效果，因此流

36、流动相的选择很重要。动相的选择很重要。2.选择流动相应注意的因素选择流动相应注意的因素79/2：5点，点， 仪器分析教程 选择流动相的注意因素：选择流动相的注意因素：（1）流动相的纯度：一般是采用分析纯试剂，必）流动相的纯度：一般是采用分析纯试剂，必要时需进一步纯化，以除去干扰的杂质。要时需进一步纯化，以除去干扰的杂质。（2）应避免使用会引起柱效损失或保留值特性变）应避免使用会引起柱效损失或保留值特性变化的溶剂。（固定相不能吸附溶剂或与流动相互化的溶剂。（固定相不能吸附溶剂或与流动相互溶。）溶。）（3）对试样要有适宜的溶解度，否则会在柱头易）对试样要有适宜的溶解度，否则会在柱头易产生沉淀。产生

37、沉淀。（4）溶剂的粘度小些为好，否则会降低试样组分）溶剂的粘度小些为好，否则会降低试样组分的扩散系数，造成传质速率缓慢，柱效下降。的扩散系数，造成传质速率缓慢，柱效下降。（5）应柱检测器相匹配（溶剂不能被相应的检）应柱检测器相匹配（溶剂不能被相应的检测器检测出来）测器检测出来）仪器分析教程3.溶剂的选择溶剂的选择79/-3： a. 依据依据：溶剂的极性是重要依据。：溶剂的极性是重要依据。 b.溶剂极性顺序，水最大，煤油最小。溶剂极性顺序，水最大，煤油最小。 c.采用多元组合溶剂系统作为流动相（底采用多元组合溶剂系统作为流动相（底液和洗脱液）（底剂决定基本的色谱分离液和洗脱液）（底剂决定基本的色

38、谱分离情况；洗脱剂则调节试样组分的滞留并对情况；洗脱剂则调节试样组分的滞留并对几个具有选择性的分离作用）几个具有选择性的分离作用） d.根据不同的方法选择合适的底液和洗脱根据不同的方法选择合适的底液和洗脱液液 仪器分析教程选用溶剂的依据：溶剂的极性。选用溶剂的依据：溶剂的极性。 正相色谱：底剂（弱极性）洗脱剂（极性较强）正相色谱：底剂（弱极性）洗脱剂（极性较强） 反相色谱：水（主体）有机溶剂调节剂。反相色谱：水（主体）有机溶剂调节剂。 离子交换色谱：组分保留值通过流动相的离子强离子交换色谱：组分保留值通过流动相的离子强度（盐的浓度）和度（盐的浓度）和pH来控制。增加盐的浓度，来控制。增加盐的浓

39、度，保留值降低；阳离子交换柱流动相保留值降低；阳离子交换柱流动相pH增加，保增加，保留值增加，阴离子交换柱相反。留值增加，阴离子交换柱相反。 排阻色谱：所用的溶剂必须与凝胶本身非常相似，排阻色谱：所用的溶剂必须与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶并防止吸附作用。这样才能润湿凝胶并防止吸附作用。仪器分析教程3-6 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 high performance liquid chromatograph仪器分析教程液相色谱仪（液相色谱仪（2）仪器分析教程液相色谱仪（液相色谱仪（3）仪器分析教程液相色谱仪（液相色谱仪（4）仪器分析教程 高效液相色谱仪构高效液相色谱仪构成：一般都具备贮

40、成：一般都具备贮液器、液器、高压泵高压泵、梯梯度洗提度洗提装置、装置、进样进样器器、色谱柱色谱柱、检测检测器器、恒温器、记录、恒温器、记录仪等主要部件。仪等主要部件。 动画仪器分析教程1.高压泵高压泵 作用：输送液体流动相。作用：输送液体流动相。要求要求： i).高压力高压力150350105 Pa;ii).流量要稳定；流量要稳定；iii).压力平稳无脉压力平稳无脉动；动；iv).对流速要有一定的可调对流速要有一定的可调范围范围.分类：分类： a .往复式柱塞泵往复式柱塞泵恒流泵恒流泵.i)供供给恒定体积的流动相，流量可给恒定体积的流动相，流量可调；调；ii)死体积小，适用梯度洗死体积小，适用

41、梯度洗提；提；iii）输出有脉动。）输出有脉动。 b.气动放大泵气动放大泵恒压泵。恒压泵。i)供给供给无脉冲的稳定流量的输出无脉冲的稳定流量的输出.ii)死死体积大，不适用梯度洗提。体积大，不适用梯度洗提。p1SA=p2SB仪器分析教程2.梯度洗提（梯度洗脱、梯度淋洗）装置梯度洗提（梯度洗脱、梯度淋洗）装置82/ a.作用：作用：与与GC 中的程序升温一样中的程序升温一样.（P22、23） b.定义定义83/1：所谓梯度洗提，就是：所谓梯度洗提，就是载液中含有两种以上载液中含有两种以上不同极性的溶剂，不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配

42、比和极性，通过载液中极性的变化来改载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以变被分离组分的分离因素，以提高分离效果提高分离效果。应用梯度。应用梯度洗提还可以使分离时间缩短，分辨能力增加，还可提高洗提还可以使分离时间缩短，分辨能力增加，还可提高最小检测量和定量分析的精度。最小检测量和定量分析的精度。 外梯度外梯度（低压梯度）：先混合后输入色谱柱；（低压梯度）：先混合后输入色谱柱； 内梯度内梯度（高压梯度）：先泵入梯度混合室再入色谱柱；（高压梯度）：先泵入梯度混合室再入色谱柱；仪器分析教程3.进样装置进样装置 a.重要性重要性83/1：进样方式及试样体积对柱效有很大

43、进样方式及试样体积对柱效有很大影响影响.要获得良好的分离效果和重现性，需要将要获得良好的分离效果和重现性，需要将试样试样“浓缩浓缩”地瞬间注入色谱柱入担体的中心成地瞬间注入色谱柱入担体的中心成一个点。一个点。 b.进样方式进样方式 1）注射器进样装置：）注射器进样装置： 由于不能承受高压，所以需用停流进样方法，但由于不能承受高压，所以需用停流进样方法，但该方式无法取得精确的保留时间，峰形的重现性该方式无法取得精确的保留时间，峰形的重现性亦较差亦较差.仪器分析教程2）高压定量进样阀高压定量进样阀通过进样阀（通常是六通阀）直接向压力系统内进样而不通过进样阀（通常是六通阀）直接向压力系统内进样而不必

44、停止流动相的一种装置（必停止流动相的一种装置（fig3-7） a.进样准备：进样准备：1和和6，2和和3连通，试样由连通，试样由5、4注入定量管；注入定量管；b.进样：阀芯顺时针进样：阀芯顺时针旋转旋转600，这时，这时1和和2，3和和4，5和和6连通，试连通，试样送入柱中样送入柱中.特点：特点：进样准确，重现进样准确，重现性好，适于定量分析性好，适于定量分析.仪器分析教程4.色谱柱色谱柱 a.参数：参数：id， 4.6或或3.9 mm； L=15-30cm； 填料颗粒度，填料颗粒度，5-10 m； n=5000-10000 b.发展趋势发展趋势 1）减小填料粒度，）减小填料粒度，3-5 m；

45、 2）减小柱内径，）减小柱内径， 1mm； c.装填方式装填方式 1）干法，填料粒度大于）干法，填料粒度大于20 m； 2）湿法（匀浆法），粒度小于）湿法（匀浆法），粒度小于20 m；(生成生成匀浆，高压装柱）匀浆，高压装柱）仪器分析教程5.检测器检测器 要求要求84/-1：具有灵敏度高、重现性好、响应快、现性范：具有灵敏度高、重现性好、响应快、现性范围宽、适用范围广、对流动相和温度波动不敏感、死体围宽、适用范围广、对流动相和温度波动不敏感、死体积小等特点积小等特点.a.紫外光度检测器紫外光度检测器85/11）原理，被分析试样组分对特定波长紫外光的选择性吸收，）原理，被分析试样组分对特定波长紫

46、外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度关系遵守比尔定律。组分浓度与吸光度关系遵守比尔定律。2）光路图，图）光路图，图3-8；3）特点特点85/3；a.具有很高灵具有很高灵敏度；敏度； b. 对温度和流速不敏感，对温度和流速不敏感，可用于梯度洗提可用于梯度洗提. 缺点缺点：不适用于对紫外光：不适用于对紫外光不吸收的试样不吸收的试样.4）发展）发展85-1；光电二极管；光电二极管211/1024个个阵列检测器阵列检测器.仪器分析教程 紫外检测器的重要进展；紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：光电二极管阵列检测器：211/1024个二极管阵列，各检个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，

47、三维立体谱图，如图所示。测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。仪器分析教程仪器分析教程光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器仪器分析教程b.荧光检测器荧光检测器86/ 1）原理：许多物质，特别是具有对称共轭结构的）原理：许多物质，特别是具有对称共轭结构的有机芳环分子受紫外光激发后，能辐射出比紫外有机芳环分子受紫外光激发后，能辐射出比紫外光波长较长的荧光，某些不发射荧光的物质亦可光波长较长的荧光，某些不发射荧光的物质亦可通过通过化学衍生化学衍生转变成能发出荧光的物质而得到检转变成能发出荧光的物质而得到检测。测。当入射光强度、试样池长度不变时，稀溶液当入射光强度、试样池长度不变时，

48、稀溶液的荧光强度与溶液浓度成正比。的荧光强度与溶液浓度成正比。 2）光路图：图）光路图：图3-11； 3）特点：荧光检测器比紫外光度检测器的灵敏度）特点：荧光检测器比紫外光度检测器的灵敏度要高要高2个数量级。但线性范围仅个数量级。但线性范围仅103，利用可调谐，利用可调谐的激光作光源（的激光作光源（激光诱导荧光激光诱导荧光）可使检测灵敏度）可使检测灵敏度和准确度都得到提高。和准确度都得到提高。仪器分析教程荧光检测器（fluorescence detector） 高灵敏度、高选择性高灵敏度、高选择性应用：应用：对多环芳烃，维对多环芳烃，维生素生素B、黄曲霉素、卟、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药

49、啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物、氨基酸、甾类化合物等有响应物等有响应 仪器分析教程c.差示折光检测器差示折光检测器通用型通用型87/1）原理：借连续测定流通池中溶液折射率的方法来测）原理：借连续测定流通池中溶液折射率的方法来测定试样浓度的检测器。溶有试样的流动相和纯流动相定试样浓度的检测器。溶有试样的流动相和纯流动相之间折射率之差，表示试样在流动相中的浓度。之间折射率之差，表示试样在流动相中的浓度。2）类型：偏转式；反射式）类型：偏转式；反射式3）定量方法：偏转式是利用测量折射角偏转值的大小定量方法：偏转式是利用测量折射角偏转值的大小来测定试样的浓度。来测定试样的浓度。4）特点特点

50、88/-1：几乎每种物质都有各自不同的折射率，几乎每种物质都有各自不同的折射率，因此都可用差示折光检测器来检测，如同因此都可用差示折光检测器来检测，如同GC中热导中热导池一样，它是一种通用型的浓度检测器。池一样，它是一种通用型的浓度检测器。5）不足不足89/1：a.对温度变化敏感；对温度变化敏感；b.不能梯度洗提不能梯度洗提.仪器分析教程仪器分析教程d.电导检测器电导检测器89/ 1）特点特点：是离子色谱法中使用最广泛的检测器：是离子色谱法中使用最广泛的检测器. 不足不足：电导检测器的响应受温度的影响较大，因：电导检测器的响应受温度的影响较大，因此要求严格控制温度此要求严格控制温度.2）原理：

51、利用物质电离后产生的电导变化来测定原理：利用物质电离后产生的电导变化来测定电离物质含量电离物质含量.（参（参P72）3）类型：）类型： a.两电极电导检测器两电极电导检测器用于低电导背景的抑制型用于低电导背景的抑制型离子色谱离子色谱. b.五电极式电导检测器五电极式电导检测器90/用于单柱型离子色谱，用于单柱型离子色谱，它有效地消除了极化和电解效应的影响，在高背它有效地消除了极化和电解效应的影响，在高背景电导下仍能获得极低的噪声水平，适用于单柱景电导下仍能获得极低的噪声水平，适用于单柱型离子色谱系统。型离子色谱系统。仪器分析教程仪器分析教程仪器分析教程（5 5）蒸）蒸发发光散射光散射检测检测器

52、器蒸蒸发发光散射光散射检测检测器是一器是一种种通用型通用型的的检测检测器，可器，可检测挥发检测挥发性低于流性低于流动动相的任何相的任何样样品，而不需要品，而不需要样样品品含有含有发发色基色基团团。蒸。蒸发发光散射光散射检测检测器器灵灵敏度比示差折光敏度比示差折光检测检测器高，器高，对温对温度度变变化不敏感，基化不敏感，基线稳线稳定，定，适合适合与与梯度洗梯度洗脱脱液相色液相色谱联谱联用。用。蒸蒸发发光散射光散射检测检测器已被广泛器已被广泛应应用用于于碳碳水化合物、水化合物、类类脂、脂肪酸和脂、脂肪酸和氨氨基酸、基酸、药药物以及聚合物等的物以及聚合物等的检检测测。仪器分析教程工作原理工作原理 雾

53、化：雾化： 液体流动相在载气压力的作用下在雾化室内转变成细小的液液体流动相在载气压力的作用下在雾化室内转变成细小的液滴，从而使溶剂更易于蒸发。液滴的大小和均匀性是保证检滴，从而使溶剂更易于蒸发。液滴的大小和均匀性是保证检测器的灵敏度和重复性的重要因素。测器的灵敏度和重复性的重要因素。 蒸发：蒸发： 载气把液滴从雾化室运送到漂移管进行蒸发。在漂移管中，载气把液滴从雾化室运送到漂移管进行蒸发。在漂移管中，溶剂被除去，留下微粒或纯溶质的小滴。溶剂被除去，留下微粒或纯溶质的小滴。 检测：检测： 光源采用光源采用650nm激光，溶质颗粒从漂移管出来后进入光检测激光，溶质颗粒从漂移管出来后进入光检测池，并

54、穿过激光光束。被溶质颗粒散射的光通过光电倍增管池，并穿过激光光束。被溶质颗粒散射的光通过光电倍增管进行收集。电信号的强弱取决于散射室中溶质颗粒大小与数进行收集。电信号的强弱取决于散射室中溶质颗粒大小与数量。量。仪器分析教程Step 1. Eluent iStep 1. Eluent is nebulized and s nebulized and small droplets small droplets are selected to are selected to minimize minimize background background noise.noise.Step 2. Sma

55、ll Step 2. Small droplets are droplets are evaporated at evaporated at low temperatures low temperatures to avoid loss of to avoid loss of pounds. Step 3. The solute Step 3. The solute particles are focusseparticles are focussed, using gas-supportd, using gas-supported focusing (GSF) for ed focusing (GSF) for enhanced signal-to-enhanced signal-to-noise ratios and less noise ratios and less maintenance, and detmaintenance, and detect the light sc