SDS_聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法

1、128中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2011年第32卷第2期SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法胡晓倩，陈来同，赵健(北京大学生命科学学院，北京100871)摘250要:目的建立一种操作简便、快速、灵敏度高、无毒的蛋白质电泳染色方法。方法利用考马斯亮蓝G-(CBBG-250)在SDS-PAGE)后对蛋白质条带进行染色，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-对不同染色条件进行探讨，并与250(CBBR-250)染色法进行比较。结果CBBG-250染色法试剂无毒，考马斯亮蓝R-背景浅，经改良其灵敏度与CBBR-250染色法相当，250染色方法简

2、单经济，达到0105g。结论CBBG-灵敏度能够满足一般要求，适用于蛋白质电泳结果的快速分析。250;灵敏度关键词:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳;染色方法;考马斯亮蓝G-中图分类号:Q503文献标识码:A1678(2011)02-0128-03文章编号:1005-InvestigationofproteinstainingprotocolsofSDS-polyacrylamidegelelectrophoresisHUXiao-qian，CHENLai-tong，ZHAOJian(SchoolofLifeSciences，PekingUniversity，Beijing100871，China)

3、Abstract:PurposeToestablishasimple，rapid，highlysensitive，non-toxicproteinelectrophoresisstainingprotocolMethodsByutilizingCoomassieBrilliantBlueG-250(CBBG-250)tostainthepro-teinbandsbySDS-polyacrylamidegelelectrophoresis(SDS-PAGE)，thedifferentdyeingconditionswereexploredandcomparedtothestainingofCoo

4、massieBrilliantBlueR-250(CBBR-250)ResultsCBBG-lightbackgroundandcomparablesensitivityafteroptimizationto250stainingprotocolpresentsnon-toxic，CBBR-250staining，whichisreaching01-05gConclusionCBBG-250stainingprotocolissimpleandeconomicItssensitivitycouldmeetthegeneralrequirements，andisapplicabletothera

5、pidanalysisofproteinelectrophoresisKeywords:SDS-PAGE;stainingmethod;CoomassieBrilliantBlueG-250;sensitivity蛋白质条带染色是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1(SDS-PAGE)中的重要步骤，染色方法有多种，考250(CBBR-250)(三苯基甲烷)染色法马斯亮蓝R-是生化实验室中蛋白质电泳检测和定量分析常用的250(CBBG-250)分子结构略方法。考马斯亮蓝G-有不同，是一种甲基取代的三苯基甲烷，广泛应用于2蛋白质溶液浓度测定，因其电泳染色灵敏度稍250差，应用较少。研究表明，酸性条件下CB

6、BG-分子的芳香环结构通过疏水相互作用形成聚集3体，在电泳染色中染料是以聚集体的形式与蛋白质结合，高浓度的硫酸铵可以使染料分子的聚集体4-5，增加，提高染色灵敏度并降低背景用中性盐作6为脱色液可以快速无毒地达到很好的效果。本250的染色液2为基础，文以BradfordCBBG-对SDS-PAGE凝胶的染色条件进行探讨和改良，力求建立一种更简便快速、灵敏的蛋白质条带染色方法。1材料大肠杆菌DH5菌株提取液来自本院分子生物学实验室;blueplusproteinmarker(包含6种已知相Mr16000对分子质量(Mr)的标准蛋白质，94000)，北京全式金生物技术有限公司;CBBG-250，Am

7、resco公司;牛血清白蛋白(BSA)(进口分装)，北京中北林格科技发展有限公司。SE250小型垂直板电泳槽及电源，瑞典GE公司;HEIOS紫外-可见分光光度计，英国UNICAM公司;凝胶成像仪，法国VilberLourmat公司;脱色摇床，美国Parmer公司。2方法01-26收稿日期:2010-作者简介:胡晓倩，女，工程师，主要从事生物化学实验教学和Email:huxiaoqianpkueducn。研究工作，中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2011年第32卷第2期12921试剂配制211CBBG-250染色液CBBG-2501

8、00mg，无85%磷酸100mL，水乙醇50mL，用去离子水稀释至1000mL，滤纸过滤备用。212固定液含50%甲醇或50%乙醇，10%乙40%去离子水。酸，213脱色液7%乙酸溶液或025mol/L氯化钾溶液。22SDS-PAGE7电泳方法参照分子克隆实验指南，采用5%浓缩胶，12%分离胶(凝胶厚度1mm)进行SDS-1没有经过固定即染色;2固定液含50%甲醇，固定05h;3固定液含50%甲醇，固定1h;4固定液含50%乙醇，固定05h;5固定液含50%乙醇，固定1h1Stainingwithoutfixation;2Containing50%Methanol，fixedfor05fixe

9、dfor1h;4Containing50%Etha-h;3Containing50%Methanol，nol，fixedfor05h;5Containing50%Ethanol，fixedfor1hPAGE电泳。电泳完毕取出凝胶，置于不同成份的固定液中固定051h;然后将凝胶置于不同成份的染色液中，振荡染色13h或过夜;弃去染色液，将凝胶置于不同成份的脱色液中脱色;对凝胶进行照相。23根据CBBG-250显色反应的机理探讨SDS对染色的影响250染色液(含15g/mLBSA，对CBBG-2g/mLSDS或含15g/mLBSA和2g/mLSDS)在320800nm波长范围内进行扫描，观察SDS对

10、染料与蛋白质结合的影响。3结果与讨论31固定液的成份及固定时间对染色效果的影响电泳过程按照常规操作，固定液中含50%甲醇图1Fig1staining固定液的成份及固定时间对染色效果的影响Theeffectoffixativecompositionandfixedtimeonthe1染色1h;2染色2h;3染色3h;4染色过夜1Stainingfor1h;2Stainingfor2h;3Stainingfor3h;4Stainingforovernight图2Fig2CBBG-250染色时间对染色效果的影响TheeffectoffixedtimeofCBBG-250onthestaining或5

11、0%乙醇，其它成分相同，固定时间05或1h做比较。染色结果显示，固定步骤是必需的，含50%甲醇固定05h即可进行染色，但固定1h染色效果更佳;含50%乙醇固定时间05h染色效果稍差，固定1h以上可达到同样效果;固定过程中更换固定液可以加强固定效果(图1)。可见乙醇完全可以替代甲醇作为固定液的有效成分，降低固定液的毒性。32CBBG-250染色时间对染色效果的影响250电泳和固定过程按照常规操作，用CBBG-2，3h或过夜，染色液染色1，结果表明染色1h已能初步观察结果，染色3h蛋白质条带颜色已到达饱和，与染色过夜的结果相当(图2)。所以染色2h能够基本满足要求，对于浓度较低的样品可适当延长染色

12、时间。33CBBG-250染色液中磷酸的含量对染色效果的影响15%，对染色液中含85%磷酸分别为10%，20%时进行染色试验，结果显示当染色液中含10%的85%磷酸时染色效果最好。反应体系的酸度影响染料分子的质子化程度，从扫描光谱看到吸收峰3的高度和位置均发生变化。当染色液中含有10%的85%磷酸时，染料分子的磺酸基仍然多处于解离状态，利于与蛋白质中的碱性氨基酸残基结合。当染色液中含有15%以上的85%磷酸时，染料分子的聚集程度增加使得部分染料分子沉淀出来，造成染色效果较差。34CBBR-250与CBBG-250染色灵敏度的比较用不同浓度的BSA溶液作为样品进行电泳，利250和CBBG-250

13、两种染色液分别染色，用CBBR-CBBR-250的染色灵敏度达到01g，CBBG-250250染色液中加的染色灵敏度仅1g。在CBBG-入10%硫酸铵，可使其染色灵敏度提高到0105g(图3)，250的染色水平。基本能达到CBBR-试验结果显示高浓度的硫酸铵能促进染料与蛋白质的结合，在提高染色灵敏度的同时没有加深背景。35脱色液的改良CBBG-250染色后背景很浅，对于浓度高的样品可以直接观察到条带，利用7%乙酸漂洗2h即可130中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2011年第32卷第2期ACBBG-250染色液;BCBBG-250染

14、色液(含15g/mLBSA);CCBBG-250染色液(含2g/mLSDS);DCBBG-250染色液(含15g/mLBSA和2g/mLSDS)ACBBG-250染色;BCBBG-250染色，染色液中含10%硫酸铵AStainedbyCBBG-250;BStainedbyCBBG-250containing10%(NH4)2SO4ACBBG-250dye;BCBBG-250dye(containing15g/mLBSA);CCBBG-250dye(containing2g/mLSDS);DCBBG-250dye(containing15g/mLBSAand2g/mLSDS)图3Fig32502

15、50染色灵敏度的影响硫酸铵对CBBG-图4Fig4SDS对CBBG-250染色的影响Theeffectof(NH4)2SO4onthesensitivityofCBBG-TheeffectofSDSonCBBG-250staining脱去背景的颜色。试用025mol/L氯化钾溶液进行脱色比乙酸脱色效果更明显，条带更清晰，且无毒无味，利于环保。36SDS对CBBG-250染色的影响250染色液及含有BSA和SDS的染对CBBG-色液在320800nm范围内进行扫描，从扫描图谱(图4)观察到，CBBG-250染色液在465和645nm有吸收峰，当染料与蛋白质结合后，在595nm处出现了一个峰与64

16、5nm的峰叠加;当染色液中含有SDS时，染料分子及其与蛋白质结合后的扫描曲线均发生了变化，第2个峰移到660nm，且595nm处的吸收变得不明显。实验中也发现SDS的存在确实影响染色效果，其原因可能是由于SDS易于与蛋白质结合，它的存在干扰染料与蛋白质的结合，从而影响染色效果。实验表明在固定步骤中更换固定液能更好地除去SDS，染色效果更好。4结论250染色本研究结果表明，通过采用CBBG-法，乙醇完全可以替代甲醇作为固定液的有效成分，这样可以降低固定液的毒性，使操作更加安全;染色液中含10%的85%磷酸时染色效果最好，在染色液中加入10%硫酸铵，可使其染色灵敏度明显提高，染色2h能够达到最佳效

17、果，对于浓度较低的样品可适当延长染色时间;用025mol/L氯化钾溶液替代7%乙酸溶液漂洗脱色效果更明显，条带更清晰，且无毒无味，有利于环保;此外固定步骤很重要，更换固定液能更好地除去SDS，染色效果更好。虽然CBBG-250染色法灵敏度略逊于CBBR-250染色250的法，但是经过实验的改良基本能达到CBBR-250能快速染色水平。本方法的优点在于CBBG-结合蛋白质，染色时间短，而背景颜色很浅，易于脱色，对于蛋白质含量较大的样品染色1h不经脱色即可观察结果，并且重复性好、稳定性强，所以CBBG-250染色法是一种经济快捷实用的方法，适用于蛋白质电泳定量分析，值得推广使用。参考文献:1郭尧君

18、蛋白质电泳实验技术M2版北京:科学出版社，2005:63-782BradfordMMArapidsensitivemethodforthequantitationofmi-crogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dye1976，72:248-254bindingJAnalBiochem，3曹稳根，焦庆才，刘茜，等考马斯亮蓝显色剂变色反应机理J化学学报，2002，60(9):1656-1661的研究4NeuhoffV，AroldN，TaubeD，etalImprovedstainingofproteinsinpolyacrylamidegelsincludingisoelectricfocusinggelswithclearbackgroundatnanogramsensitivityusingCoomassieBrilliantBlueJEle