园参、野山参、西洋参中水溶性蛋白成分的比较研究

1、园参、野山参、西洋参中水溶性蛋白成分的比较研究                    作者：幺宝金，赵雨，邢楠楠，张梅【摘要】   目的对园参、野山参及西洋参中水溶性蛋白成分进行比较研究，为人参药材的鉴别和质量评价提供依据。方法采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）及凝胶电泳像分析，比较三者在蛋白分布及含量上的差异。结果园参、野山参、西洋参的SDS-PAGE图谱及凝胶分析图谱存在很大差异。结论可以通过S

2、DS-PAGE法对园参、野山参、西洋参进行鉴别、质量评价及药效关系探究。 【关键词】   园参； 野山参； 西洋参； 水溶性蛋白； SDS-PAGE      人参为五加科植物人参Panax ginseng C. A. Meyer.的干燥根，按生长状态的不同分为园参和野山参。园参是指人工栽培的人参，野山参是指野外 自然 生长的人参。西洋参为五加科植物西洋参Panax quinquefolium L.的干燥根。在药性及作用方面，三者均有一定的差异。野山参的药效高于园参，尤其在大补元气和复脉固脱方面功效明显。人参和西洋参的功效亦有区别，人

3、参性温，兴奋中枢、抗疲劳等作用较西洋参强；西洋参性寒，益气生津、镇静解热作用较人参强。对园参、野山参及西洋参的药材性状、显微结构、理化性质等方面的研究已有很多的报道14，但有关三者蛋白类成分的报道却较少。本实验通过SDS-PAGE法对园参、野山参、西洋参中的水溶性蛋白进行研究，为进一步探讨园参、野山参、西洋参的质量评价及药效关系奠定基础5，6 。 1  仪器与材料    DS-1型高速捣碎机（上海标本模型厂）；高速离心机Minispin（德国Eppendorf公司）；CP225D型 电子 天平（十万分之一,北京赛多利斯仪器系统有限公司）；透析带（XH420，截留分

4、子量：6000-8000）；LL3000 型冷冻干燥机（德国Heto公司）；Multiskan MK3型酶标仪（Thermo公司）；DYY-8C型电泳仪（北京六一仪器厂）；JD801凝胶电泳图像分析系统（江苏省捷达科技 有限公司）；Tris(Sigma公司)；硫酸铵（Sigma公司）；SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳低分子量标准蛋白（分子量依次为：97.0 kDa，66.2 kDa，43.0 kDa，31.0 kDa，20.1 kDa，14.4 kDa）,购自于中科院上海生物化学研究所。其它试剂均为国产分析纯。5年生园参、野山参及西洋参均购自于吉林省靖宇县，经长春中医药大学研发中心姜大成教授鉴定，人参

5、为五加科（Araliaceae）植物Panax ginseng C. A. Meyer的干燥根茎，野生者为野山参。西洋参为五加科植物西洋参Panax quinquefolium L.的干燥根茎，符合 中国 药典（2005版部）的规定。 2  方法与结果 2.1   园参、野山参、西洋参水溶性蛋白的制备取5年生园参、野山参、西洋参鲜品适量，称重，高速组织捣碎机粉碎，加适量含0.15 mol/L NaCl的pH 7.4 10 mmol/L Tris-HCl缓冲液，4浸提24h，10 000 r/min离心10min，上清液用80%硫酸铵沉淀，4静置过夜，沉淀加适量体积

6、的pH7.4 10mmol/L Tris-HCl缓冲液溶解，对蒸馏水过夜透析，-20预冻，冻干，得三者的水溶性蛋白，收率见表1。表1  园参、野山参、西洋参水溶性蛋白的收率（略）   由表1可知，野山参及西洋参中水溶性蛋白的含量较园参中的蛋白低很多，西洋参中的水溶性蛋白为园参的50%左右，而野山参中的水溶性蛋白，仅为园参的10%。2.2 SDS-PAGE检测及凝胶图谱分析取上述制备的蛋白样品各5 mg，用蒸馏水配制成浓度为5 mg/ml的蛋白溶液，经SDS-PAGE检测（分离胶浓度为15%，浓缩胶浓度为5%。浓缩胶电压为70 mV，分离胶电压140 mV。电泳结束

7、后用考马斯亮蓝R250染色，最后用含45%甲醇和10%冰醋酸的水溶液脱色至背景清晰），结果见图1。采用JD801凝胶电泳图像分析系统对电泳结果进行分析，生成各泳道密度曲线图横轴为泳带的迁移率（Rf），纵轴为泳带的积分光密度值（IOD），结果见图25，每条泳带对应的分子量、迁移率、积分光密度值及其百分比（每条泳带的积分光密度值占整个泳道所有条带积分光密度值的百分比）见表25。表2  低分子量标准蛋白电泳泳道密度曲线图数据（略）表3  园参水溶性蛋白电泳泳道密度曲线图数据（略）表4  野山参水溶性蛋白电泳泳道密度曲线图数据（略）表5  西洋参水溶性蛋白电泳泳

8、道密度曲线图数据（略）            由电泳结果可知，园参、野山参和西洋参的水溶性蛋白存在很大的差异，尤其是园参与野山参的差异最大。通过JD801凝胶电泳像分析系统的分析结果可以看出，三者的蛋白的分子量主要分布在60 00010 000Da范围内，但在含量上却存在很大的不同。园参蛋白包括分子量为60 229.34Da，38 819.94Da，27 634.28Da，25 151.99Da，21 276.71Da，18 187.72Da，16 467.65Da，10 448.78Da等8种

9、蛋白，含量均比较高，其中分子量为27 634.28Da和25 151.99Da的蛋白的含量最高，其次为分子量60 229.34Da，16 467.65Da的两种蛋白；野山参蛋白包括分子量为60 229.34Da，48 607.40Da，38 617.48Da，28 218.35Da，26 641.09Da，22 536.37Da，14 832.50Da，9 313.36Da等8种蛋白，但含量比较高的蛋白只有两种，分子量分别为60 229.34Da，14 832.50Da，其它几种蛋白的含量较园参均比较低；西洋参蛋白包括分子量为60 229.34Da，41 118.23Da，39 023.45D

10、a，27 634.28Da，21 840.31Da，18 572.13Da，15 466.11Da，10 781.79Da等8种蛋白，其中分子量为27 634.28Da， 60 229.34Da，18 572.13Da 3种蛋白的含量较高，其它几种蛋白的含量较园参也均比较低。 3  讨论    中药所含化学成分非常复杂。目前，对这些成分的研究往往集中于糖、生物碱、苷类、挥发油等。而另一些在中药里普遍存在的成分，尤其是蛋白质等生物大分子研究相对薄弱。动、植物种间所含的蛋白质种类是稳定的, 这可能与动植物在长期的系统发育中是靠它来保持个体的遗传特性有关。因此, 利用蛋

11、白质种类的不同来鉴别那些亲缘关系相近、成分相似、性状类同的中药是可行的7。近年来国内有许多学者利用多种手段对园参、野山参和西洋参进行鉴别47，但由于三者的性状、成分极其相似，现有的方法难以将它们完全区分开来，因此，有必要寻求新的快速灵敏的鉴别方法。SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳技术作为一种分离鉴定蛋白质的手段, 已广泛用于生理、生化、微生物学、遗传学等学科的研究。在电泳过程中，兼有浓缩效应、分子筛效应以及电荷效应, 具有灵敏度高、分析速度快、分辨率高、重复性好等特点8。经过JD801凝胶电泳图像分析系统对SDS凝胶电泳胶片的扫描，生成更直观的谱图形式，并导出重要的技术参数，这改变了常规SDS-PA

12、GE定性鉴别方法，通过技术参数可提供更可靠的鉴别依据。因此，本研究利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）结合凝胶电泳图像分析系统，对园参、野山参和西洋参中水溶性蛋白进行分析，发现三者的蛋白质在分布及含量上存在很大的差异，因此采用此方法对三者进行鉴定及质量评价。已有 文献 报道，人参蛋白具有抗真菌、抗病毒、精氨酸酶活性、抗脂质分解、抗血红细胞聚积等药理活性911，因此，依据三者在药效学方面的不同，我们可以对其差异性蛋白进行药理活性研究，探讨其作用机制，为进一步开发新药奠定基础。【 参考 文献】   1杨文志，曹志强，罗晓萍，等. 园参、野山参、西洋参薄层层析鉴别方法J.人

13、参研究,1999，2:36.2陈军力，朱晓明，李国仁，等. 山参的种类特征与生态的关系J.中成药,1995,17（7）:44.3印敏芳. 山参质量的鉴别J. 中国 药业,2006,15（9）:56.4楼余淦，凌明，程存归，等. 生晒山参、西洋参、红参和生晒参的FTIR图谱研究J.中草药,2003,34（7）:665.5吴谦, 俞瑜，杨燕军，等. Panax属西洋参、人参及三七的蛋白电泳指纹鉴别J. 中药材,1999,22(11): 559.6李凤英, 崔蕊静, 李春华，等. 西洋参、人参及其伪品的蛋白电泳鉴别J. 中国中药杂志,1990,15(6): 11.7杨九艳，青梅，杰俊峰，等. 人参、

14、西洋参及桔梗的凝胶电泳鉴别J. 内蒙古院学报,1999,21(4): 256.8宋广运，石俊英PAGE技术在中药鉴定中的J山东省 科学 院院刊，1989，2 (1)：579M Ji Y. Yoon. Purification and characterization of a 28-kDa major protn fromginseng rootJ .Comparative Biochemistry and Physiology Part B， 132 (2002) 551. 10Seung II KIM; Kweon Soo-Mi. Characterization of RNase-like major storage protn from the ginseng root by proteomic approachJ. Journal