重金属铜_锌_镉_铅复合污染对土壤环境微生物群落的影响

1、文章编号:025322468(200320120022206 中图分类号:X172 文献标识码:A重金属铜、锌、镉、铅复合污染对土壤环境微生物群落的影响王秀丽, 徐建民*, 姚槐应, 谢正苗(浙江大学土水资源与环境研究所, 杭州 310029摘要:以铜锌冶炼厂附近的水稻土为例, 研究了重金属复合污染对土壤微生物群落的影响. 结果表明, 有效铜、锌、镉、铅与微生物生物量碳、微生物生物量氮、微生物商、微生物生物量氮P 全氮均呈显著负相关. 重金属污染均能降低细菌、真菌和放线菌的数量. 用BIO LO G 生态盘研究了重金属污染对微生物群落结构的影响, 发现重金属污染明显影响了微生物群落结构, 反映

2、在典型变量1(CV1与重金属元素含量呈极显著正相关, 因此认为典型变量1是反映重金属污染程度的有效指标. 经逐步回归分析发现, 有效铜是影响典型变量1最主要的因素. 关键词:重金属; 微生物群落; 土壤微生物生物量Effects of Cu , Zn , Cd and Pb compound contamination on soil microbial communityW ANG Xiuli, XU Jianmin, YAO Huaiying, XIE Zhengmiao(Institu te o f S oi l and Water Reso u rces and Env iron me

3、n tal Sci 2ence, Zhejian g Univ ersity, Han g zho u 310029, C hinaAbstract :Padd y soi ls arou nd a sm elter were used to assess the effects o f heav y metal co mp ou nd co n tamin ati on o n so il m icro bial co m m uni ty. The sig ni fican tly neg ati ve co rrelatio n between the av ail ab ility o

4、 f C u, Zn, Cd and Pb and mi cro bial bio m ass carbo n(C m ic , m icrobi al bio m ass n itro gen(Nmic, micro bial q uo tient, and rati o o f Nm ic to to tal n itrog en w as f ou nd. The n um ber o f bacteria, fun gi and actin o m ycetes decreased with the inc rease o f p ollu tio n d egree. M u lti

5、v ariate analy sis o f so le carb on so u rce utili zati o n pat tern i ndicated that heav y metal po llu tio n had a si g nificant i mp ac t on m icro bi al c o mm un ity structu re b ased o n the sig nifican t co rrelatio n be tween C V1(can on ical vari ate1 an d heav y metals. Therefo re, C V1is

6、 reg ard ed to be a p o ten tially g o od i ndex of so il heav y m etal p ollu tio n. Step wise reg re ssio n analy sis ind icated th at av ai lable C u i s the mo s t sig nificant facto r fo r c on tro llin g C V1.Key words :h eav y m etal; m icro bial c o mm un ity; so il microb ial bi o mass收稿日期:

7、2002201224; 修订日期:2002204217基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(G1999011809和高等学校骨干教师资助计划资助作者简介:王秀丽(1976 , 女, 硕士研究生; *通讯联系人, E 2m ail:j xumail.hz. z j. cn土壤微生物群落与土壤重金属污染之间的关系是国内外环境科学领域的一个研究热点. 重金属污染能够明显影响土壤的微生物群落, 如能降低土壤微生物生物量1, 降低活性细菌菌落的数量2等等, 同时重金属污染亦能明显影响土壤微生物群落结构3, 即土壤微生物多样性, 已有研究表明微生物群落结构的变化能较早地预测土壤养分及环境质量的变化过程,

8、 被认为是最有潜力的敏感性生物指标4. BIO LO G 碳素利用法是近年来发展的能根据微生物利用碳源引起指示剂的变化, 检测和判断不同的微生物群落结构. 最近Knight 已成功地将BIO LO G 方法应用于评价重金属污染对微生物群落多样性的影响5. 但国外在这一方面的研究主要是针对旱地土壤, 对水稻土的研究几乎没有, 况且大多数研究都是通过添加外源重金属来模拟污染土壤, 难以反映土壤的实际污染情况, 国内在这方面的报道几乎没有. 鉴于此, 本文采集了铜锌第23卷第1期2003年1月环 境 科 学 学 报A C TA SCIEN TIA E CIRC UM S TAN TIAEVol. 2

9、3, No. 1Jan. , 2003冶炼厂附近遭受重金属铜、锌、镉、铅不同程度污染的水稻土, 测定了土壤的微生物生物量, 微生物商以及微生物群落结构等指标, 其中微生物商是土壤微生物生物量碳和总有机碳的比值6. 旨在探索重金属污染和土壤生物学指标之间的内在联系, 为揭示重金属胁迫对土壤微生物群落的影响机理提供相关依据. 1 材料和方法1. 1 供试土壤供试土壤为水稻土, 采自浙江省富阳市环山乡, 该乡的年平均降雨量为1400mm, 平均气温为16e . 距铜锌冶炼厂东部10、100、200、600、800、1000、1200、1400、1800、5000m 进行采样(分别为1 10号土样 ,

10、 土样均为0 20cm 的表层土, 且均为8点混合样. 新鲜土样采集后拣去植物残体, 一部分土样直接过2mm 筛后, 供土壤微生物学性质的测定. 另一部分土样经风干后, 碾磨过筛, 供土壤基本理化性质的测定, 土壤基本理化性质列于表1.表1 土壤基本理化性质Table 1 Soil basic properties土样号离冶炼厂距离,kmpH 有机碳, g P kg 全氮,g P kg 全磷,(P 2O 5 %有效氮, mg P kg C EC ,cm ol P kg C P N 比10. 016. 524. 402. 790. 12615911. 58. 7520. 026. 724. 07

11、2. 780. 13216012. 08. 6730. 28. 028. 182. 730. 16816310. 210. 3140. 48. 024. 482. 800. 20714614. 68. 7450. 67. 834. 093. 740. 24424217. 79. 1161. 07. 932. 313. 350. 26222213. 19. 6571. 28. 127. 873. 130. 25818615. 18. 9181. 47. 933. 953. 440. 19124310. 09. 8691. 87. 727. 803. 410. 25019917. 28. 1410

12、5. 05. 924. 443. 040. 2652139. 608. 051. 2 测定方法土壤铜、锌、镉、铅全量分析采用氢氟酸 硝酸 高氯酸消煮, 原子吸收分光光度法测定7. 有效态铜、锌、镉、铅采用D TPA 浸提原子吸收分光光度法测定7. 细菌、真菌和放线菌菌落的测定采用稀释平板法8. 采用熏蒸浸提法测定土壤微生物生物量碳9, 浸提液中的有机碳采用总有机碳分析仪(日本Shimadzu TOC 2500 测定. 同样采用熏蒸浸提法测定土壤微生物生物量氮, 浸提液中的氮采用凯氏消煮法测定10.采用BIO LO G 生态盘测定微生物群落结构, 盘内有96个小孔, 一个空白对照和31种碳源为一

13、个系列, 每个测试盘内有3个系列. 试验中根据微生物利用碳源引起指示剂的变化, 检测和判断不同的微生物群落结构. 取相当于5g 干土重的预培养新鲜土样, 放入含50mL 无菌水的三角瓶内, 震荡10min 后, 用无菌水分步稀释到103倍的土壤稀释液. 稀释液经离心(900r P min 去除残留的土壤后, 吸取上清液用于接种. 接种后的测试盘在25e 生化培养箱中培养152h, 每隔一定的时间用BIO L OG(美国MicroL og TMSyste m410 自动读数装置在405nm 下测定吸光值, 平均吸光值被作为整体活性的有效指数之一. 上述操作均在无菌条件下进行. 1. 3 统计分析

14、用Genstar513(NAG L TD, Oxford, UK 软件对BI OL OG 数据进行分析, 为了缩小不同重复间接种密度差异引起的误差, BIO L OG 读数在分析前用平均吸光值进行了校正. 吸光值先用主成分分析(PCA 降维后, 再用典型变量分析法(CV A 分析. 用SPSS 统计软件对典型变量和重金属含量之间进行逐步回归分析. 2 结果2. 1 土壤重金属污染供试土壤中全铜、全锌、全镉、全铅的变化范围分别为4612 489510mg P kg 、9613 113310mg P kg 、619 3410mg P kg 、1217 25715mg P kg, 见表2. 据报道,

15、 浙江省土壤中铜、锌、镉、铅的背景值分别为610 3310mg P kg 、2511 16813mg P kg 、0103 1109mg P kg 和817 4415mg P kg. 这表明供试土壤中铜、锌、镉、铅都有一定程度的污染, 其中铜是最主要的污染元素. 统计结果表明土壤中铜、锌、镉、铅全量与其有效性都达到了极显著水平, 相关系数分别为01983*、01823*、01889*和01948*.表2 土壤重金属元素含量Table 2 Soil heavy metal contents土样号全铜, m g P kg 全锌, mg P kg 全镉, m g P kg 全铅, m g P kg

16、有效铜, m g P kg 有效锌, mg P kg 有效镉, m g P kg 有效铅, mg P kg 14895. 01133. 028. 8257. 51340. 2392. 57. 3075. 4621470. 51122. 920. 6132. 2546. 9378. 02. 9841. 3331084. 61037. 234. 040. 5434. 0186. 57. 4532. 264751. 0881. 624. 532. 0366. 6106. 37. 1021. 315473. 1848. 322. 236. 7261. 4121. 35. 8824. 156464. 5

17、691. 822. 425. 3254. 0107. 54. 1715. 577416. 0717. 220. 413. 695. 3138. 72. 5317. 188228. 0488. 120. 512. 7103. 3103. 51. 7413. 909173. 0444. 310. 234. 263. 282. 60. 9611. 921046. 296. 36. 924. 05. 78. 34. 382. 2 土壤微生物生物量、微生物商、微生物生物量氮P 全氮比和微生物C P N 比表3结果显示, 重金属胁迫对土壤微生物生物量碳、微生物生物量氮的影响与重金属含量表3 土壤微生物学性

18、质Table 3 Soil microbi al properties土样号微生物生物量碳, m g P kg 微生物商,%微生物生物量氮, m g P kg微生物生物量氮占全氮的百分比, %微生物C P N 真菌菌落数, 个P g(土 (103 放线菌菌落数, 个P g(土(105细菌菌落数,个P g(土 (107142. 30. 179. 80. 354. 320. 950. 100. 25261. 50. 1811. 20. 415. 472. 500. 500. 453153. 00. 2221. 90. 806. 971. 321. 071. 154235. 42. 6428. 41

19、. 028. 282. 944. 722. 065456. 60. 9364. 11. 717. 123. 1410. 001. 256315. 80. 7330. 90. 9210. 211. 654. 241. 897350. 50. 5540. 61. 308. 635. 8010. 401. 868645. 61. 03106. 43. 096. 075. 683. 980. 9491205. 71. 6497. 02. 8412. 435. 4016. 200. 9210785. 54. 93103. 13. 407. 6212. 5033. 002. 68有密切关系, 随着污染程度

20、的加剧, 土壤微生物生物量碳、氮均有明显的降低趋势. 相关分析表明, 微生物生物量碳、氮和有效铜、锌、镉、铅都呈显著负相关(表4 . 结果还显示, 微生物商和微生物生物量氮P 全氮比随着离冶炼厂距离的增加有明显的降低趋势, 与有效铜、锌、镉、铅都呈显著负相关. 土壤有效铜、锌、镉、铅与土壤微生物C P N 比都有一定的负相关系趋势, 说明了重金属污染在一定程度上影响了微生物C P N 比.表4 土壤有效铜、锌、镉、铅与土壤生物学指标之间的相关系数Table 4 C orrelation coefficient between soi l available C u, Zn, C d, Pb a

21、nd s oil biological indicators项目微生物生物量碳微生物生物量氮微生物生物量氮占全氮的百分比微生物商微生物C P N 细菌菌落数放线菌菌落数真菌菌落数典型变量1有效铜-0. 666*-0. 690*-0. 695*-0. 646*-0. 628-0. 625-0. 576-0. 6180. 946*有效锌-0. 696*-0. 730*-0. 747*-0. 690*-0. 644*-0. 783*-0. 671*-0. 6260. 829*有效镉-0. 722*-0. 733*-0. 752*-0. 734*-0. 374-0. 269-0. 672*-0. 79

22、0*0. 731*有效铅-0. 673*-0. 695*-0. 709*-0. 663*-0. 665*-0. 717*-0. 611-0. 633*0. 942*注:n =10, *p <0. 05*p <0. 012. 3 土壤细菌、真菌和放线菌的菌落数用菌落计数法测定了细菌、真菌、放线菌的菌落数, 结果显示了细菌、真菌和放线菌的菌落数与有效铜、锌、镉、铅均有一定程度的负相关趋势, 但其显著水平不尽相同. 2. 4 BIO L OG 测定的微生物群落结构从图1可知, 10个供试土壤的平均吸光值(A WCD 随着培养时间的增加呈明显的上升趋势, 10个供试土壤的平均吸光值之间也有

23、一定的区别. 本试验用典型变量分析对数据进行了整理分类, 结果表明, 典型变量1和典型变量2分别解释了42195%和40176%的变异. 图2结果显示, 在污染较重的土壤中, 3个重复土样的典型变量标准误比较大, 而在污染较轻的土壤中, 3个重复土样的典型变量标准误比较小. 同时由表4可知, 污染土壤的有效铜、锌、镉、铅与典型变量1都呈极显著正相关. 图1 B IOLOG 测试盘平均吸光值(AWCD 随时间的变化图Fig. 1 Plot of ordination of AWC D agai nst time图2 典型变量1(CV1 和典型变量2(CV2 之间的关系(误差线代表三个重复土样之间

24、的标准误大小 Fi g. 2 Rel ations hip between CV1and C V23 讨论本研究结果显示, 微生物生物量碳、氮与土壤有效铜、锌、镉、铅都呈显著负相关, 这与许多报道是一致的, 即无论在实地受污染的土壤中, 还是在外加重金属的土壤中, 微生物生物量都有明显的降低11,12, 重金属污染可能影响了细胞代谢及微生物的功能, 从而使种群的大小发生改变. 微生物商与土壤重金属含量都呈显著负相关, 可能直接与重金属胁迫对微生物生物量的影响有关. 微生物生物量氮P 全氮比与土壤重金属含量亦呈显著负相关, 可能原因也与重金属胁迫对微生物生物量的影响有关, 或者是由于重金属胁迫降

25、低了微生物对基质氮的利用率. 许多研究都表明重金属污染能导致微生物碳P 氮比的变化, 一般随着重金属含量的提高, 微生物碳P 氮比有明显的上升趋势, 这可能是由于有耐受性的真菌生物量的增加所致13. 而本文的研究却发现, 重金属污染在一定程度上降低了微生物碳P 氮比, 看来, 重金属污染土壤中, 微生物种群的变化并非同一规律, 这可能与多种重金属复合污染的综合效应有关.有研究表明, 细菌、真菌和放线菌的数量在受铅污染的土壤中比在未污染的土壤中有明显的降低14. 本文用特定的选择性培养基对细菌、真菌和放线菌进行菌落计数, 结果表明随着污染程度的提高, 菌落数有一定程度的降低趋势, 重金属污染影响

26、了细菌、真菌和放线菌群落的大小. 由表4可以明显的看出, 有效镉与真菌和放线菌的相关性都达到了极显著和显著水平, 而与细菌没有相关性, 可能是由于细菌对镉的耐受性比较大, 而真菌和放线菌对镉的耐受性比较小. 但也有研究表明, 重金属污染明显降低了细菌和放线菌的数量, 对真菌数量却没有影响15, 这可能与真菌对重金属的耐受性超过了细菌和放线菌对重金属的耐受性有关. 上述分析表明了用细菌、真菌和放线菌菌落数来反映重金属污染程度有一定的局限性.采用BIO L OG 碳素利用法对微生物群落结构进行研究发现, 微生物群落结构在污染土壤和未污染土壤中有很大区别, 并且与污染土壤中重金属的含量密切相关, 主

27、要表现在两个方面:(1 重金属污染对平均吸光值的影响(平均吸光值反映的是微生物对碳源的利用能力 . (2 重金属污染对BIO L OG 代谢剖面的影响. 由图1可知, 在污染最严重的土壤(1号土壤 中, BI 2O L OG 盘的颜色变化最慢, 并且总体的平均吸光值也最低, 与其它土壤的平均吸光值有明显区别. 随着重金属含量的降低, BIO LO G 盘的颜色变化逐渐加快, 其总体的平均吸光值也有一定的上升趋势, BIOL O G 盘的颜色变化可能是不同污染程度的土壤有不同的微生物群落性质引起的, 也可能是由于微生物群落的大小变化引起的. 值得提出的是, 作为对照的10号土壤的平均吸光值也比较

28、低, 这可能与该土样的pH 值有关, 该土样pH 值为519, 其它土样的pH 都大于615, 而传统的BI OL OG 盘内的缓冲液pH 为615, 因此, 一些在酸性条件下快速生长而在中性条件下缓慢生长的微生物不能有效利用BIO L OG 体系中的碳源.从图2可以看出, 1、2、3、4、5号土壤和对照土壤的C V1有显著差异, 而6、7、8、9号土壤和对照土壤的CV1没有显著差异, 说明了1、2、3、4、5号土壤的污染程度较重, 而6、7、8、9号土壤的污染程度较轻. 因此可以推断出引起微生物群落系统性变异的重金属临界值可能在5号土壤和6号土壤的重金属含量之间. 从图2亦可以反映出随着重金

29、属污染程度的加剧, 三个重复土样之间的CV1标准误有增加的趋势, 说明了重金属污染导致了微生物群落的变异性增大, 降低了群落的稳定性. 由表4可知, 污染土壤的有效铜、锌、镉、铅与C V1的相关系数都达到了极显著水平, 表明了微生物群落结构产生了系统性的改变, 同时也更充分的证明了C V1可以反映重金属的污染程度. 为了进一步揭示重金属污染对微生物群落结构的影响, 本文采用SPSS 统计软件对有效铜、锌、镉、铅和C V1之间进行了逐步回归分析, 设定在A =0105水平引入变量和A =0110水平剔除变量的临界值, 所建模型为:CV1=-01207+5195010-4Cu(R 2=01894、

30、F =671719*、T =81229*, 从这里可以看出, 所建模型的F 检验值达到A =0110的极显著水平, 这充分反映了所建模型的可靠性. 进入回归方程的自变量的偏回归系数的T 检验26环 境 科 学 学 报23卷1期 王秀丽等: 重 金属铜、 镉、 锌、 铅复合污染对土壤环境微生物群落的影响 27 值也是极显著的, 表明了有效铜对 CV1 的影响达到了极显著水平, 也就是说有效铜对微生物 群落结构的影响达到了极显著水平. 自变量的决定系数不仅反映了自变量和 CV1 之间的数量 关系, 还揭示了自变量对 CV1 的影响程度. 本文所建模型中, 可以说明有效铜对 CV1 的贡献率 最大,

31、 为 01894. 因此认为, 有效铜是影响 CV1 的主要因素, 同时也说明了在供试土壤铜、 锌、 镉、 铅复合污染中, 铜是引起土壤微生物群落结构变化的主要污染元素. 4 结论 重金属铜、 镉、 锌、 铅复合污染对土壤微生物群落有较大的影响, 复合污染能够明显降低微 生物生物量、 微生物商和微生物氮P全氮比, 同时在一定程度上也降低了微生物碳P氮比. 菌落 计数也表明重金属复合污染能导致了细菌、 真菌、 放线菌菌落数降低. 微生物群落结构受土壤 重金属污染的影响很明显, 其中典型变量 1 是判断重金属污染对微生物群落结构影响程度的 良好指标. 逐步回归说明了有效铜是影响典型变量 1 的主要

32、因素. 本文的研究结果也说明, 用 单一的生物学指标评价土壤的污染程度有一定的局限性, 结合传统的生物学指标( 微生物生物 量、 微生物商等 和微生物群落结构的评价( BIOLOG , 能够更好地判断重金属污染对微生物群 落的影响程度. 参考文献: 1 2 3 Brookes P C, McGrath S P. Effect s of met al toxicity on the size of the soil microbial bio mass J . Journal of Soil Science, 1984, 35: 341 346 Jordan M J, LeChevalier M

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34、 in coniferous forests J . Applied Environmental and Microbiology, 1996, 62: 420 428 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 孙波, 等. 土壤质量与持续环境. III 土壤质量评价的生物学指标 J . 土壤, 1997, 29( 5 : 225 234 Kinght B P, McGrat h. S P, Chaudri A M. Biomass carbon measurements and substrate ut ilizat ion patterns of microbial po

35、pulations from soils amended with cadmium. copper. or zinc J . Appl ied Environmental and Microbiology, 1997, 63: 39 43 任天志. 持续农业中的土壤生物指标研究J . 中国农业科学, 2000, 33(1 : 68 75 鲁如坤. 土壤农业化学分析方法 M . 北京: 中国农业科技出版社, 1999 中国科学院南京土壤研究所微生物室. 土壤微生物研究法M . 北京: 科学出版社, 1985 Vance E D, Brookes P C, Jenkinson D S. An extraction method for me