可见分光光度法和紫外分光光度法教学指导

1、第十三章 可见分光光度法和紫外分光光度法首 页基本要求重点难点讲授学时内容提要1 基本要求 TOP 1.1 掌握分光光度法的基本原理，LambertBeer定律以及透光率、吸光度、摩尔吸光系数等基本概念及相互关系。1.2 熟悉物质对光的选择性吸收，吸收光谱的意义；可见分光光度法的测定方法标准曲线法和标准对照法。1.3 了解光的基本性质，光的加和性；分光光度计的基本构造；比吸光系数比较法、差示分光光度法和双波长法的测定方法；提高测量灵敏度和准确度的方法；紫外分光光度法的一般概念。2 重点难点 TOP2.1 重点分光光度法原理Lambert-Beer定律。2.2 难点提高测量灵敏度和准确度的方法。

2、3 讲授学时 TOP建议3学时4 内容提要 TOP 第一节 第二节 第三节 第四节 第五节4.1 第一节 物质的吸收光谱当光照射到某物质或某溶液时，只有光子的能量(hn)与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差(DE)相等时，才能被吸收。不同物质的基态和激发态的能量差不同，选择吸收光子的能量也不同，即吸收的波长不同。光的能量与波长成反比，波长越短，能量越高。有色溶液的颜色是它所选择吸收光的补色，吸收越多，则补色的颜色越深。比较溶液颜色的深度，实质上是比较溶液对光的吸收程度。任何一种溶液对不同波长的光的吸收程度是不同的。以波长l为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，得到的曲线为吸收光谱。吸收光谱描述了物

3、质对不同波长的光的吸收能力，吸光度最大处的波长为最大吸收波长。不同的物质有不同的吸收光谱，最大吸收波长也不同，它可以对物质进行初步的定性分析。吸收光谱是分光光度分析中选择测定波长的重要依据。通常选用最大吸收波长为测定波长，具有最高的灵敏度。4.2 第二节 分光光度法基本原理 TOP 透光率和吸光度当一束平行单色光照射到溶液时，若不考虑光的反射， 则入射光强度I0，吸收光强度Ia，透射光强度为It之间的关系为I0 Ia + It （13.1）透射光的强度It与入射光强度I0之比称为透光率T表示 （13.2）透光率的负对数称为吸光度，用符号A表示。 （13.3）4.2.2 Lambert-Beer

4、定律Lambert和Beer研究了吸光度A与液层厚度b和溶液浓度c之间的定量关系。得出吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。这就是LambertBeer定律，是光吸收的基本定律。A kbc （13.4）k与被测物质性质、入射光波长、溶剂、溶液浓度及温度有关。当b以cm，c以物质的量浓度(mol×L-1) 为单位时，k称为摩尔吸光系数，以e表示，单位为L×mol -1×cm-1，LambertBeer定律可表示为A ebc (13.5)若用质量浓度r(g×L-1)代替物质的量浓度c，则LambertBeer定律可表示为A abr （13.6）式中的a为

5、质量吸光系数，单位为L× g -1×cm-1。a和e可通过下式相互换算e aMB （13.7）M表示被测物质的摩尔质量。医药学上还常用比吸光系数来代替摩尔吸光系数。当溶液组成标度为10 g×L-1时，可用表示，它与e和a的关系分别为： (13.8) (13.9)LambertBeer定律仅适用于单一波长的单色光。e、 a或越大，表明溶液对入射光的吸收就越强，测定的灵敏度就越高。4.3 第三节 可见分光光度法 TOP4.3.1 分光光度计分光光度法所采用的仪器称为可见分光光度计。基本部件及相互间的关系如下： 检测器指示器光源单色器吸收池 4.3.2 定量分析方法应用

6、分光光度法定量测定时，入射光一般选择lmax的单色光，常用的定量分析方法有标准曲线法和标准比较法二种。 (一) 标准曲线法配制一系列浓度不同的标准溶液，在lmax处分别测量它们的吸光度。以标准溶液的浓度为横坐标，相应的吸光度为纵坐标作图，得到一条标准曲线，然后在相同条件下测量待测溶液的吸光度，从标准曲线上查得待测溶液的浓度。(二) 标准对照法配制一个与被测溶液组成标度相近的标准溶液(浓度为cs)，测得吸光度为As。然后在相同条件下测得被测溶液的吸光度Ax，根据LambertBeer定律计算其试样溶液的浓度cx为： (13.10)4.4 第四节 提高测量灵敏度和准确度的方法 TOP4.4.1 分

7、光光度法的误差分光光度法的误差主要来源于溶液偏离Beer定律引起的误差、仪器误差和主观误差。(一)仪器测定误差仪器测定误差是由光电管的灵敏性差、光电流测量不准、光源不稳定及读数不准等因素引起的。(二)溶液偏离Beer定律引起的误差溶液偏离Beer定律引起的误差表现为A-c曲线的线性较差，常出现弯曲。产生这种情况的主要原因有1.化学方面 吸光物质不稳定，因浓度改变而发生解离、缔合、溶剂化等现象致使溶液的吸光度改变。2.光学方面 入射光的纯度不够，实际上经分光光度计的单色器得到的是一个狭小波长范围的复色光。(三)主观误差由于操作不当引起的误差称为主观误差。应严格按操作步骤仔细进行，尽可能减少或避免

8、。4.4.2 提高测量灵敏度和准确度的方法(一)选择适当的显色剂许多物质本身无色或颜色不明显，不能直接用可见分光光度法进行测定。测定时，通过显色反应形成稳定的、具有特征颜色的有色物质。显色剂应满足：（1）灵敏度高，即选择能使生成的有色物质的e较大的反应，一般e值应达到104105。（2）选择性好，指显色剂仅与一个组分或少数几个组分发生显色反应。显色剂的颜色应与显色反应产物的颜色有较大的差异，以避免显色剂本身对测定产生干扰。（3）显色剂在测定波长处无明显吸收。（4）反应生成的有色化合物组成恒定。(二) 选择合适的测定条件1.入射光波长的选择 入射光波长应根据吸收光谱选择。溶液中无干扰物质存在时，

9、通常选择波长为lmax的光作入射光，因在该波长处溶液的吸光系数最大，测定的灵敏度最高。2.显色剂的用量 固定被测组分浓度和其它反应条件，改变显色剂用量测定相应的吸光度，通过实验从吸光度与显色剂用量的曲线来确定合适的显色剂用量。3.溶液的酸度 固定溶液中待测组分和显色剂的浓度，改变溶液的pH值，测定溶液体系的吸光度，作吸光度ApH曲线，根据吸光度ApH曲线确定最适宜的pH范围。4.显色温度 通过实验从A-T曲线确定最适宜的显色温度。5.显色时间 通过实验从A-t曲线确定最适宜的显色时间。(三)空白溶液的选择在测定溶液吸光度时，一般采用溶剂空白、试剂空白或试样空白作对照，来消除溶剂或其它物质对入射光的吸收，以及光在溶液中的散射和吸收池界面对光的反射等与被测物吸收无关所带来的影响。（四）共存离子的干扰及其消除为消除一些有颜色，或是与显色剂反应形成有色物质的共存离子干扰，常通过控制显色