基质金属蛋白酶在心肌肥厚大鼠细胞外基质重塑中的作用及氯沙坦干

1、基质金属蛋白酶在心肌肥厚大鼠细胞外基质重塑中的作用及氯沙坦干预         作者：白江涛 陆凤翔 许迪 陈莉 周蕾 雍永宏 【关键词】 心肌肥厚 Role of metalloproteinases in rat cardiac extracellular matrix remodeling and effects of losartan on it 【Abstract】 AIM: To investigate the role of metalloproteinase (MMP9), tissue inhib

2、         ; 作者：白江涛 陆凤翔 许迪 陈莉 周蕾 雍永宏 【关键词】; 心肌肥厚 Role of metalloproteinases in rat cardiac extracellular matrix remodeling and effects of losartan on it 【Abstract】 AIM: To investigate the role of metalloproteinase (MMP9), tissue inhibitor of metalloproteinase (T

3、IMP1) and transforming growth factor1 (TGF1) in cardiac hypertrophy and extracellular matrix remodeling and the effects of Losartan on it in a rat model. METHODS:; Male SD rats were randomly divided into three groups: control group, norepinephrine group (1.06 mgkg-1d-1×15 d) and; norepinephrine

4、 + Losartan group (10 mgkg-1d-1×15 d). The rat cardiac hypertrophy models were established by intraperitoneal injection of norepinephrine (NE) twice a day for 15 days. Cardiac hypertrophy and extracellular matrix remodeling were evaluated by echocardiography and morphological examination. The m

5、RNA and protein expression of matrix; metalloproteinase (MMP9), tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP1) and transforming growth factor1 (TGF1) was examined by reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR) and immunohistochemical analysis. RESULTS:; NEinduced hypertrophy and extracellu

6、lar matrix remodeling predominantly occurred in the left ventricular and the mRNA and protein expression of the MMP9, TIMP1 and TGF1 elevated (P<0.01). After Losartan treatment, the interventricular septal thickness, total collagen, type I, type III collagen and the expression of MMP9 and TGF1 de

7、creased (P<0.01). CONCLUSION: MMP9, TIMP1 and TGF1 are involved in the cardiac extracellular matrix remodeling induced by NE. Losartan can prevent the cardiac hypertrophy and extracellular matrix remodeling, which is associated with the attenuation of myocardial MMP9 and TGF1. 【Keywords】 cardiac

8、hypertrophy; extracellular matrix; metalloproteinase; Losartan 【摘要】 目的： 探讨基质金属蛋白酶(MMP9)及其生理性抑制剂TIMP1和转化生长因子1（TGF1）在心肌肥厚大鼠细胞外基质重塑中的作用及氯沙坦干预的效果. 方法： 雄性SD大鼠随机分为3组：对照组;去甲肾上腺素(norepinephrine, NE)组（1.06 mgkg-1d-1×15 d）;NE+氯沙坦组（10 mgkg-1d-1×15 d）. NE腹腔注射，2次d-1，连续15 d，建立心肌肥厚的模型. 应用超声心动图及病理学方法评价整体心

9、肌肥厚和组织胶原的表达. 用逆转录聚合酶链反应法（RTPCR）及免疫组化方法检测MMP9, TIMP1和TGF1 mRNA和蛋白表达情况. 结果：大鼠腹腔注射NE后发生左心室肥厚及纤维化，胶原的含量及MMP9, TIMP1和TGF1的蛋白、mRNA的表达显著高于健康对照组（P<0.01）. 氯沙坦能降低室间隔的厚度，减少左室心肌中总体胶原、I型、III型胶原的合成及MMP9,TGF1的表达（P<0.01）. 结论： MMP9, TIMP1和TGF1与NE诱导的心肌细胞外基质重塑有关. 氯沙坦能有效的防治心肌肥厚及细胞外基质重塑,这一效应与其降低心肌中高表达的MMP9和TGF1有关.

10、 【关键词】 心肌肥厚；细胞外基质；基质金属蛋白酶；氯沙坦 0引言 基质金属蛋白酶（metalloproteinases, MMPs）是一类包含锌离子的内源性蛋白水解酶，是细胞外基质（ECM）的主要生理调节因子. 最近研究发现，MMPs在心梗后心衰的发病机制中具有重要的作用1. 转化生长因子（TGF1）被证实能促进组织纤维化和ECM积聚，. 有关延缓或防止心肌重塑的发展及其相关机制的研究，一直是心血管领域的热点. 我们旨在探讨MMP9及其生理性抑制剂TIMP1和TGF1在大鼠心肌肥厚及细胞外基质重塑过程中的作用及氯沙坦的防治作用. 1材料和方法 1.1材料动物模型及分组： 雄性SD大鼠25只（

11、南京医科大学动物实验中心），体质量250280 g，随机分为3组: 对照组（n=8）；去甲肾上腺素组(norepinephrine, NE) (n=8)；NE+氯沙坦（默沙东公司）(n=9). NE注射液1.06 mgkg-1d-1, 腹腔注射,2次d-1，连续给药15 d，制备心肌肥厚模型，对照组腹腔注射生理盐水及蒸馏水灌胃. 氯沙坦10 mgkg-1d-1早晨1次灌胃给药，疗程15 d. 1.2方法 L-1甲醛液固定，石蜡包埋，4 m切片. VanGieson(VG)染色法使胶原特殊染色，光镜检查，心肌细胞呈黄色，胶原呈红色，并用全自动图像分析仪行图像处理. 每个标本选一个切片，测量左心室

12、心肌的胶原容积分数(CVF)(左心室胶原面积/所测视野面积). 随机取4个视野，以均值作为该心脏的CVF. L-1过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，热修复抗原后，100 mLL-1正常山羊血清封闭非特异性抗原. 滴加一抗（1100稀释）（购自武汉博士德生物公司），4过夜. 滴加生物素标记的二抗；37孵育30 min；滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液；DAB显色，封片. 以TBS代替一抗作阴性对照. 应用多功能彩色图像分析系统对I型和III型胶原（心肌细胞间隙及血管周围棕色条纹）、MMP9, TIMP1, TGF1蛋白（细胞质中棕褐色颗粒为阳性）表达进行图像分析，表达强度用平均灰度值表示. L-1

13、dNTP 1 L,RNAase抑制剂0.5 L,MMLV逆转录酶 L(美国Promega),5×MMLV缓冲液2 L, DEPC水1.5 L, 42 60 min, 95 5 min终止反应. 合成的cDNA 4保存. 聚合酶链反应：Eppendorf管中依次加入cDNA 1 L,10×PCR缓冲液2 L,上下游引物各0.5 L, MgCl2 0.3 L,Taq DNA聚合酶0.3 L,10 mmolL-1 dNTP 0.3 L,双蒸水14.2 L. 95变性30 s,退火30 s，72延伸1 min, MMP9的退火温度为59,最适循环数为28个循环；TIMP1的退火温度为60,最适循环数为32个循环；TGF1的退火温度为55,最适循环数为30个循环. 72延伸7 min. 取上述PCR产