AGEN 中文版去内毒素大提试剂盒

1、纯化高转染级别的质粒DNA 【工作台流程】BENCH PROTOCOL准备工作：1.将RNase A 溶液加入P1缓冲液(Buffer P1)2.加40ml96100乙醇(ethanol)于试剂盒的去内毒素水中(endotoxin-fre water)3.可选：加 LyseBlue 试剂于 Buffer P14.检查 Buffer P2是否有SDS沉淀precipitation 有沉淀可在37摄氏度下暖化溶解5.Buffer P3 置于4摄氏度中预冷pre-chill6.细菌扩增培养补充：1. 准备4-6个50ml新的或灭菌的离心管用于冷冻离心机下离心过夜菌液，2个用于接下来的菌块重悬和与bu

2、ffer混合2. 1个无内毒素的30ml聚丙烯（不推荐聚碳酸酯，因为不耐乙醇）管子（最好用圆底的离心管以利于高速离心）用于收集洗提的质粒DNA3. 5个1.5ml的EP管用于收集抽提过程各步骤的产物用于实验后分析和质量控制4. 准备1个冰浴盒用于步骤65. 准备室温下的异丙醇10.5ml6. 4摄氏度冰冻离心机和分光光度仪,琼脂糖凝胶电泳步骤：peocedureA.细菌培养、收获和裂解 bacterial culture,harvest & lysis1.100ml高拷贝high-copy或250ml低拷贝low-copy过夜overnight LB培养菌液于冰冻离心机4摄氏度； 60

3、00×g；15min   从新鲜的抗生素平板上挑取一个单菌落，2-5ml抗生素LB液体初始培养基30摄氏度孵化约8小时（振荡300rpm，注意孵化容器容积至少4倍于培养液）   抗生素LB液体培养基稀释初始培养液到1:500-1000。(高拷贝质粒100-200ul初始培养液加于100ml培养基；低拷贝质粒250-500ul初始培养液加于250ml培养基)37摄氏度300rpm振荡12-16小时。(孵化容器容积至少4倍于培养液，培养至细菌密度约3-4×109/ml，即离心后菌块湿重约3g/L培养基)   培养基配方

4、：10g蛋白胨+5g酵母+10g氯化钠 溶于800ml蒸馏水，用1 N NaOH 调pH值至7.0，用蒸馏水调整至1L。   可将离心后菌块-20摄氏度下冰冻保存暂时终止实验。2.于10ml Buffer P1中重悬浮resuspend细菌沉淀bacterial pellet，混匀   必须重悬彻底，涡流振荡器或移液器反复吹打至没有菌块 3.加入10ml Buffer P2，剧烈vigorously翻转invert4-6次混合，置于incubate室温5min   在室温孵化期间准备QIAfilter 过滤筒cartridge：在滤筒

5、出水口outlet喷嘴nozzle拧上screw帽子，将滤筒置于管架备用  加入buffer P2后不要使用涡流振荡器(以免剪切细菌DNA)，裂解反应不要超过5分钟。buffer P2用完要拧紧盖子以免酸化。4.加10ml预冷的 Buffer P3，剧烈翻转4-6次混合加入buffer P3后析出绒毛样物质(细菌DNA，蛋白，细胞碎片和KDS)，裂解液粘性下降。如果裂解液仍然粘稠度大，说明混合不够。很重要的是混合好后迅速倒入滤筒，以防止扰动沉淀层。B.细菌裂解清除 bacterial lysate clearing5.将裂解液倒入pour滤筒内，置室温(15-25摄氏度)1

6、0min，不要套入滤筒活塞plunger！从喷嘴处取掉滤筒的帽子，缓慢轻柔的将活塞插入滤筒并滤过细菌裂解液于50ml试管中   在静置的10分钟里不要搅动滤筒内的裂解液。析出物会慢慢上浮于上层。如果过了10分钟析出物未浮在上层，可用消毒的移液器枪尖驱赶滤筒壁上的析出物。   取120ul过滤后裂解液样本(Sample1)用于实验后分析胶，确定生长和裂解条件是否最佳。6.加2.5ml Buffer ER 到过滤好的裂解液中，翻转约10次使其混合，冰浴30minC.结合、洗涤和抽提质粒DNA bind,wash & elute plasmid DNA

7、7.用10ml Buffer QBT 平衡equilibrate QIAGEN-tip 500，并保持重力流动gravity flow排空柱筒empty column8.使用第6步骤得到的过滤裂解液加入QIAGEN-tip柱中使其重力流动通过树脂resin   取120ul通过树脂后的裂解液样本(Sample2)用于实验后分析胶，确定质粒DNA结合于树脂的效率。9.2×30ml Buffer QC洗涤QIAGEN-tip   第一步洗涤质粒准备过程中大多数污染物，第二步洗涤特别针对培养液过多或所用菌种含糖量较多的情况。  

8、取240ul洗涤液样本(Sample3)用于实验后分析胶   注意：以下步骤均为无内毒素操作，需使用无内毒素的聚丙烯塑料管或预处理的玻璃器皿(消毒后180摄氏度烘箱过夜)10.15ml buffer QN 抽提DNA   用30ml的无内毒素管子收集。如果质粒DNA大于45-50kb，将抽提缓冲液QN 65摄氏度预热后使用会提高产量   取60ul洗提样本(Sample4)用于实验后分析胶   可将洗提液存于4摄氏度保存以暂停实验，但时间不宜过夜。D.沉淀、洗涤和再溶解质粒DNA precipitate,wash

9、& redissolve plasmid DNA11.加入10.5ml室温异丙醇(isopropanol)到抽提的DNA中并混合。4摄氏度冰冻离心机>=15,000×g，30min离心，小心的去上清dacant the supernatant    尽管离心在4摄氏度离心机下以防止样本过热，但所有溶液须为室温以减少盐沉淀。离心前可在离心管上标记以明确离心后DNA斑块的位置。12.用5ml 70室温的去内毒素乙醇(去内毒素水中加入40ml 96-100乙醇)洗涤DNA沉淀，>=15,000×g，10min离心。小心去上清避免扰动沉淀13.空气中干燥air-dry沉淀5-10min，重新溶解DNA到适量的去内毒素的 Buffer TE 中。    冲洗管壁以完全重新溶解所有DNA(特别是