细胞裂解液中RH123的HPLC的检测方法及其在细胞摄取实验中的

1、细胞裂解液中RH123的HPLC的检测方法及其在细胞摄取实验中的应用药学院 陆渊 指导老师 郁韵秋摘要：本实验拟采用体外培养小鼠脑微血管内皮细胞（BCECs）的方法，研究伊曲康唑对BCECs上P-gp功能的影响。实验将主要包括建立细胞裂解液中罗丹明123的HPLC-FLD的检测方法，并进行方法验证；小鼠脑微血管内皮细胞的分离、纯化和培养；RH123细胞摄取实验以及数据的处理和分析。通过本实验对伊曲康唑对P-糖蛋白功能的潜在影响进行探究。建立一种细胞裂解液中罗丹明123的HPLC的检测方法，并将其应用于研究伊曲康唑对小鼠脑微血管内皮细胞上P-糖蛋白功能的影响。关键词：罗丹明123、BCECs、P

2、-糖蛋白、HPLC、伊曲康唑、细胞裂解液Abstract: The aim of this study is to figure out whether Itraconazole is an inhibitor of P-gp. To achieve this, we use brain capillary endothelial cells (BCECs) as a model and Rhodamine 123 as the substrate to evaluate the effect of Itraconzaole on P-gp. A sensitive and rapid hig

3、h-performance liquid chromatography (HPLC) method with fluorometric detection after simple sample preparation procedure was developed for the determination of Rh123 in P-gp efflux studies. This method has been successfully applied to the qualification of Rhodamine123 in cell lysate obtained from P-g

4、p efflux study conducted in brain capillary endothelial cells and can be employed for determination of the potential effect on P-gp.Keywords: Rhodamine 123, BCECs, P-gp, HPLC, Itraconazole, cell lysate前言伊曲康唑( Itraconazole，ITZ)是一种高效、广谱的口服三唑类抗真菌制剂，临床用于治疗浅部和深部的真菌感染，其对人体的毒副作用较小1。两性霉素B和伊曲康唑联合使用，能有效提高治疗效果

5、，但两者的相互作用机制仍不明确。有观点认为2，具有高组织亲和性的伊曲康唑，能够与血脑屏障上存在的P-糖蛋白结合，抑制其将药物从脑组织转运回血液的功能，从而保证两性霉素B在脑组织中维持有效的治疗浓度。1. 课题背景1.1 P-糖蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein , P-gp)是一种分子量为170ku的跨膜糖蛋白，由1280个氨基酸残基组成，具有12个跨膜区和2个细胞内ATP连结点。P-gp由多药耐药(multidrug resistance, MDR)基因编码，而MDR基因可分为有外排作用的P-gp(包括人MDRI、小鼠和大鼠的mdr1a和mdrlb和仓鼠的P-gp 1和P-gp 2

6、)和无外排作用的P-gp(如人的MDR2也称MDR3、小鼠和大鼠的mdr2和仓鼠的P-gp 3)。P-gp外排作用的生物学实质为细胞对生存环境中可能遇到的细胞毒物(或药物)加以排斥，降低细胞内该毒物(或药物)的积累而达到自我保护。P-gp分布广泛，在肿瘤细胞和血脑屏障等正常组织上都有表达。P-gp 转运物质的分子量从250Da 到1850Da不等。被P-gp转运的化合物一般都含有芳族基，多数被P-gp高效转运的化合物是碱性或不带电的。所有被P-gp 转运物质的共同结构特点是多少都含有疏水成分，P-gp的转运功能依赖药物插入膜脂质双层的能力（即药物的疏水性）。1.2血脑屏障上P-糖蛋白的表达血脑

7、屏障(blood brain barrier,BBB)由脑毛细血管内皮细胞(brain capillary endothelial cells, BCECs)、基膜和胶质细胞足突3部分构成。BBB的主要作用是保护脑免遭毒性物质的损害和维持脑内环境的稳定，这一作用部分是通过BCECs上P-gp的外排作用实现的。BBB能阻止大部分亲水物质的通透，亲脂性化合物则可以通过脂溶性扩散的方式通过BBB。然而Levin早在70 年代就发现某些亲脂性化合物难以通过血脑屏障的现象不能用以前的脂溶性扩散的理论来解释3。后来研究发现构成BBB 的脑微血管内皮细胞(BCECs)腔面有P-糖蛋白(P-gp)的高表达，B

8、CECs上的P-gp的外排作用是这些化合物难以通过的原因 4。P-糖蛋白底物如: 阿霉素、长春碱、环孢菌素A 等难以在脑内达到较高浓度是由于BBB上P-gp 的外排作用引起的。P-gp基因敲除大鼠使用长春碱后脑内药物浓度增加80多倍, 毒性也显著增强。研究P-gp抑制剂对BBB上P-gp的作用, 一方面可以探讨使用高效低毒的P-gp抑制剂以提高需在脑内发挥药效的药物浓度, 提高临床上对脑肿瘤及颅内感染的治疗，或者用于逆转肿瘤耐药的治疗；另一方面对于研究P-gp抑制剂可能引起或增强其它药物中枢系统毒副作用方面也有重要意义。11.11.21.3 罗丹明123罗丹明123（其结构如图1所示）为已知的

9、P-糖蛋白底物，在相关P-gp的研究常常用其作为验证影响P-gp生物学功能的手段。在本研究中，若伊曲康唑为P-糖蛋白的抑制剂，则P-糖蛋白较少的泵出罗丹明123，在细胞摄取的罗丹明123的量会增加。因此，本文建立一种罗丹明123的HPLC-FLD检测方法以监测在细胞摄取实验中罗丹明123含量的变化。Fig.1. 罗丹明123的结构实验部分1 仪器、药品和试剂1.1仪器Agilent 1100型高效液相色谱仪：包括G1322A Vacuum Degasser 在线脱气，G1312A Binary Pump 高压双泵，G1313A ALS Autosampler 自动进样器，G1316A Ther

10、mostatted Column Compartment 柱温箱，G1321A Fluorescence Detector 荧光检测器和色谱工作站AB204-E型分析天平：Mettler Toledo Instrument (Shanghai) Ltd，ChinaDelta 320型pH计：Mettler Toledo Instrument (Shanghai) Ltd，China XW-80A型涡旋混合器： 上海医科大学仪器厂Millipore Direct-Q 纯净水发生器1.2化学品和试剂伊曲康唑（由华山医院提供）；罗丹明123和内标罗丹明B购于Sigma(St. Louis, MO,

11、USA)；环孢菌素A购于广东医药公司（中国，广州）Triton X-100 国药集团化学试剂有限公司磷酸和磷酸二氢钠 中国医药（集团）上海化学试剂公司，分析纯；甲醇 Tedia Company InC , USA, HPLC Grade；1.3 溶液的配制1.3.1 储备液和工作液的配制配制1.0 以及 1.1 mg/mL罗丹明123储备液，配制1mg/mL以及500ug/mL罗丹明B储备液，两者都以甲醇为溶剂，储存于-20。适当的用甲醇稀释罗丹明123和罗丹明B的储备液得到一系列工作液。11.11.21.31.4 标准曲线和质控样品的配制用空白细胞裂解液适当稀释工作液得到标准曲线，浓度分别为

12、1.0, 2.0, 5.0, 10.0, 20.0, 50.0, 100.0 ng/mL。质控样品用于衡量方法的精密度和准确度的浓度为LLOQ（Lower Limit of Qualification）(1ng/mL)、 低 (4.4ng/mL)、 中 (44ng/mL)、 高 (88ng/mL)。所有质控样品储存于-20。2. 罗丹明123浓度测定的色谱条件色谱柱：YMC 反相C18色谱柱(5m, 250mm4.6mm, USA) 柱温： 40流动相：甲醇:15mM的磷酸氢钠（pH 6.0）=80:20 流速： 1ml/min激发波长：505nm， 发射波长： 534nm(0-4min)，

13、580nm(4.01-7min)3. BCEC细胞摄取伊曲康唑和环孢菌素A实验1233.1 细胞培养根据Xie et al5的方法培养原代BCEC细胞。方法为在加入胎牛血清(20%)、青霉素(100 U/mL)、链霉素(100 mg/L)、谷氨酰胺(2 mmol/L)、内皮细胞生长因子ECGF (100 mg/L)、肝素的标准细胞培养液（DMEM）中培养。培养条件：37，5% CO2。装培养液的T-25烧瓶事先加入明胶方便细胞贴壁培养。细胞长好后用胰蛋白酶再孵育使细胞消化下来。将细胞接种在24孔板内，密度为每孔1104个细胞。在实验前孵育48小时，显微镜观察其均匀度和形态学。3.2 细胞摄取实

14、验细胞在Hanks缓冲液(HBSS at pH 7.4; 0.185g/L CaCl22H2O, 0.09767g/L MgSO4, 0.4g/L KCl, 0.06g/L KH2PO4, 0.35g/L NaHCO3, 8.0g/L NaCl, 0.04788g/L Na2HPO4, 1.0g/L 葡萄糖)的条件下摄取罗丹明123(5.0mM)，罗丹明123(5.0mM)和环孢菌素A(3.0mM)，罗丹明123(5.0mM)和伊曲康唑(5.0mM)，孵育时间为30，60，90分钟。孵育结束后，弃去Hanks缓冲液和药液，用冰Hanks缓冲液冲洗三次洗下细胞，再加入450mL 1% Trito

15、n X-100保存在4过夜。分别取100mL标准样品，质控样品以及细胞摄取实验样品的细胞裂解液，各加入20mL内标，涡旋约10秒钟。混合后10000 rpm离心10min。取上清液15mL进样作HPLC分析。1233.13.23.3 细胞蛋白质浓度检测由于罗丹明123的浓度表示为每毫克蛋白质中摄取的罗丹明123的纳摩尔数，需要检测细胞裂解液中蛋白质的浓度。细胞裂解液中蛋白质的浓度按照Bradford法检测6。具体如下：3.3.1 配制考马斯亮蓝G-250溶液称取50 mg考马斯亮蓝G-250，溶于25 ml 95乙醇中，加入85（W/V）的磷酸50 ml，最后用蒸馏水定容到500 ml。3.3

16、.2 蛋白标准液BSA（1mg/ml）作为标准蛋白。配成浓度为0、0.02、0.04、0.1、0.16、0.2(mg/ml) BSA标准液。3.3.3 样品测定BSA标准液按3.3.2项所示浓度取样，稍漩涡混匀。分别取样品100ml，加入膜溶剂400ml，稍漩涡混匀。分别于各管加入蛋白试剂2.5 ml，立即漩涡2min，5min后595 nm测定吸光度。4 结果12344.1 色谱行为按上述实验处理方法及色谱条件，在本课题所建立的色谱条件下测得空白细胞裂解液、含有内标罗丹明B的细胞裂解液、含有罗丹明123（浓度为44ng/mL）以及罗丹明B的细胞裂解液、人脐静脉血细胞样品的典型色谱图（Fig.

17、2）。罗丹明123和内标达到基线分离，出峰处并无明显杂质干扰。ABCDFig.2. 从上到下分别为A.空白细胞裂解液 B.含有内标罗丹明B的细胞裂解液 C.含有罗丹明123（浓度为44ng/mL）以及罗丹明B的细胞裂解液 D.人脐静脉血细胞样品色谱图4.2 标准曲线取罗丹明123浓度为1, 2, 5, 10, 20,50,100ng/mL的标准细胞裂解液样品，按“1.4” 项下处理并进行分析，连续三天。以罗丹明123和内标罗丹明B的峰面积比值与罗丹明123的相应浓度做线性回归。每个浓度有平行三份样品。标准曲线见表1。Table 1. Calibration Curve obtained on

18、three consecutive days (n=3)day 1day 2day 3meanS.D.RSD(%)slope0.02770.0280.02230.0270.00312.34intercept-0.0046-0.0008-0.0060.00390.012-70.81R20.99970.99920.99930.99940.00020.034.3 最低定量限依据本法，当细胞裂解液中罗丹明123的浓度为1ng/mL时，待测峰分离完全，信噪比S/N5，日内和日间精密度均小于9.65%，准确度均小于13.64%。空白细胞裂解液色谱图（Fig.2）显示出峰位置无明显杂质峰干扰，故可作为定量限

19、。色谱图见Fig.3Fig.3 最低定量限 (Rh123 1ng/mL)4.4 精密度与准确度配置不同浓度的质控样品（LLOQ、低、中、高四个浓度，每个浓度五个平行样品，连续五天），按“1.4”项下处理并进行分析。结果如表2所示。Table 2. Intra- and inter-day precision and accuracy for QCs and LOQ of Rh123 in cell lysateAnalyteAdded(ng/mL)Intra-day（n=5）Inter-day（n=5）Found(meanS.D.)(ng/mL)Accuracy(%)RSD（%）Found(m

20、eanS.D.)(ng/mL)Accuracy(%)RSD（%）Rh1231.01.050.06895.746.430.950.09286.369.654.44.350.2198.864.894.250.3296.597.574446.211.08105.032.3545.822.75104.145.998894.113.79106.954.0192.693.47105.333.744.5 方法回收率配制浓度为1、4.4、44、88ng/mL的罗丹明123质控细胞裂解液样品，按“1.4” 项下方法进行处理后进样分析。以处理后的样品色谱峰面积与相应浓度直接进样后所得峰面积相比，得绝对回收率，其结

21、果见表3。Table 3. Extraction recovery of Rh123 in cell lysate (n=3)AnalyteConcentration spiked(ng/mL)Extraction recovery(%, meanS.D.)RSD(%)Rh1231.0100.783.553.534.4100.210.970.9744104.170.590.5788101.810.670.654.6 稳定性考察低、中、高三个浓度的质控样品储存在-70 下24小时后在室温下，完全融化后进样分析，在-70 下继续放置24小时，如此进行三次循环。低、中、高三个浓度的质控样品还进行了室

22、温6小时稳定性考察以及 48小时4稳定性考察。结果见Fig.4ABCFig.4. 罗丹明123的稳定性实验考察。低 (4.4ng/mL)、 中(44ng/mL)、 高(88ng/mL) 三个浓度. 由上至下分别为A.冻融稳定性考察 B.室温6小时稳定性考察 C.48小时4稳定性考察。12344.14.24.34.44.54.64.7 方法应用：BCEC细胞摄取伊曲康唑和环孢菌素A实验456将验证后的方法应用于BCEC细胞摄取伊曲康唑和环孢菌素A实验，检测细胞摄取药物后，细胞裂解液中P-糖蛋白底物罗丹明123的浓度。孵育时，以加环孢菌素A的罗丹明123为阳性对照组，空白罗丹明123为阴性对照组，

23、考察加入伊曲康唑的罗丹明123浓度的变化情况，以判断伊曲康唑是否为P-糖蛋白的抑制剂。按“3.2”项下方法进行细胞摄取实验，计算出罗丹明123的浓度，按照“3.3”项下的方法的得到细胞裂解液中蛋白质的浓度。将罗丹明123的浓度用蛋白质浓度归一化后得到一系列数据，见表4。Table 4 the concentration of Rh123 after uptake experiment with BCECs (n=4)Time(min)Concentration of Rh123(nM/protein, meanS.D.)Concentration of Rh123(nM/protein, me

24、anS.D.)Concentration of Rh123（nM/protein, meanS.D.）Rh123Rh123+CsARh123+ITZ301.40500.06331.26010.22721.53270.3561601.46950.53831.62920.41231.46520.74371202.54080.43252.81400.40111.89260.2968Fig. 5 BCEC细胞摄取实验。根据表4所得数据，以时间为横坐标，被摄取的罗丹明123浓度（细胞蛋白质浓度归一化后）为纵坐标。考察时间分别为30、60、90分钟。蓝色为空白阴性对照，药物为罗丹明123；紫色为阳性对照，

25、药物为罗丹明123及环孢菌素A；黄色为待检验组，药物为罗丹明123及伊曲康唑5 结论本课题建立了一种灵敏可靠的高效液相（HPLC）荧光检测法检测细胞裂解液中罗丹明123的浓度，罗丹明B作为为内标。本方法的专属性、精密度、准确度和线性均符合生物样品的分析要求，与文献方法相比7-8本方法灵敏度提高，专属性好，干扰小，最低检测限达到了1ng/mL；前处理方法简单。方法可以用于细胞裂解液中罗丹明123的浓度测定，为确证伊曲康唑是否为P-糖蛋白提供依据。之后进行了一系列BCEC细胞摄取伊曲康唑和环孢菌素A实验，并用已经建立的HPLC-FLD方法检测细胞摄取实验后罗丹明123的浓度。6 讨论566.1 测

26、定波长的选择光谱扫描结果表明，罗丹明123 和罗丹明B的最大发射波长分别为535nm和580nm。因此本实验采用程序控制方法：0至4min发射波长为535nm，检测罗丹明123的信号，从4.01min开始发射波长从535改为580nm。从而提高了罗丹明B的灵敏度，且基线未产生明显波动。6.2 细胞摄取实验实验结果与预期结果并不是十分吻合。不仅伊曲康唑对P-糖蛋白的作用不明显，环孢菌素A作为阳性对照组对P-糖蛋白的抑制情况亦不是十分明显。分析原因一方面可能是因为所用的细胞BCECs上表达的P-gp量不足，导致外排被抑制作用不明显，不能很好的反映抑制剂的抑制作用； 另一方面可能是因为所选用的底物罗

27、丹明123并不是最佳底物。因此以罗丹明123作为底物探究三唑类抗真菌药对于P-糖蛋白的影响并非最佳选择。可以考虑选用Caco-2细胞或者一些基因工程细胞比如NIH-3T3-G185细胞系（NIH-3T3-G185细胞系含有多药耐药基因的基因产物）代替现在所用的BCEC细胞；也可以考虑替换底物，把罗丹明123换为daunorubicin (DNR)。因为有文献报道伊曲康唑能够增加一种多药耐药细胞鼠急性白血病细胞对DNR的摄取9。参考文献1 杨晓玲. 伊曲康唑不良反应国内文献综述J. 药物流行病学杂志, 2003, 12(2):68-692 Miyama, T., H. Takanaga, H.

28、Matsuo, K. Yamano, K. Yamamoto, T. Iga, M.Naito, T. Tsuruo, H. Ishizuka, Y. Kawahara, and Y. Sawada. 1998. P-glycoprotein-mediated transport of itraconazole across the blood-brain barrier. Antimicrob. Agents Chemother. 42:17381744.3 Levin V. Relationship of octanol/ water partition coefficient and molecular weight to rat b